论文摘要
目的探讨丹参诱导骨随间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）分化为神经样细胞优化方案可行性及分化后的神经样细胞是否具有神经生理功能。方法取4～5代状态好的MSC加入含10%胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）及10 ng/ml的碱性成纤维生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）的培养基预诱导24 h,更换为含60 mg/L丹参液和10 ng/ml bFGF的无血清培养基（诱导液）诱导2 h,加FBS（工作浓度为10%）进行去分化,约24 h后再次更换为诱导液诱导3 h,如此重复45次,且每次诱导时间较前延长1 h,诱导后分别进行免疫荧光细胞化学,细胞膜电位（Membrane potential, MP）、细胞内钙流以及神经突触循环功能检测。以50 mmol/L的KCl作为诱发动作电位刺激因子,采用激光共聚焦显微镜（Laser-scanning confocal microscope, LSCM）对DiBAC4（3）、Fluo-3/AM、SynaptoRed C-2进行荧光激发,检测分化神经细胞对细胞外高钾刺激下细胞膜电位变化,胞内钙流变化及细胞突触循环功能。结果加入预诱导液24 h内,MSC形态未见明显改变;更换为诱导液诱导2 h即可见部分MSC开始收缩,伸出突起,向神经性细胞形态转变,5次诱导6小时后,细胞胞体继续缩小,突起拉长交互成复杂网状;免疫荧光细胞化学显示未经处理的MSC神经元巢蛋白（Nestin,神经干细胞特异性表面标志）表达率为（41.6±3.3）% （（x|-）±s, n=3）,第1次诱导2 h后,Nestin表达率高达（98.1±1.5）% （（x|-）±s, n=3）,但不表达神经微丝蛋白（Neurofilament protein, NF,成熟神经元表面标志）、TUJ-1（成熟神经元表面标志）及突触小泡蛋白（Synaptophysin,成熟神经元表面标志）,也不表达胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein, GFAP,星形胶质细胞表面标志）;第4次诱导1 h后即突触Synaptophysin,表达率（95.3±1.6） % （（x|-）±s, n=3）,5 h后Synaptophysin表达更为广泛。5次诱导6 h后的神经样细胞TUJ-1、NF、Synaptophysin均表达阳性,TUJ-1表达率为（96.6±2.4）% （（x|-）±s, n=3）,NF表达率为（96.7±2.8）% （（x|-）±s, n=3）,Synaptophysin表达率为（96.2±2.1）% （（x|-）±s, n=3）。膜电位检测显示加入高浓度KCl后,神经样细胞胞内荧光强度瞬时增强,膜电位变化曲线发生瞬时陡升,而MSC未发生任何变化,曲线保持于水平线。钙流检测显示神经样细胞受高钾刺激前,其胞内钙流在小范围内波动,被高钾刺激后,荧光强度瞬时增强,增强幅度远高于刺激前,说明胞内钙流增强。突触循环检测显示神经样细胞首次被高钾激发后细胞被SynaptoRed-C2染色发出红色荧光,当再次被高钾激发后细胞荧光强度降低,细胞在两次高钾刺激后发生胞吞胞吐作用。结论丹参反复多次诱导MSC神经性分化的优化方案可高效快速诱导MSC分化为具有神经电生理的神经样细胞。目的探讨丹参对缺氧缺血性脑损（Hypoxic ischemic brain damage, HIBD）新生鼠内源性神经干细胞（Neural stem cells, NSC）迁移及分化的影响。方法对6日龄新生大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶（5-bromo-2 -deoxyuridine, BrdU）以标记内源性NSC,于7日龄时制备为缺氧缺血性脑病（Hypoxic ischemic encephalopathy, HIE）动物模型,并于当日起连续5天腹腔注射60 mg/kg丹参进行干预,对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水。分别于大鼠发生HIBD后3天、2周及4周后处死动物,进行TTC染色、BrdU免疫组织化学检测及BrdU/Nestin、BrdU/GFAP、BrdU/TUJ1免疫荧光双标检测。结果TTC染色可见HIE丹参干预组脑组织坏死程度远小于HIBD生理盐水对照组。假手术组左右大脑半球BrdU阳性细胞数分别为214.86±14.07（（x|-）±s, n=8）和215.63±15.98（（x|-）±s, n=8）,两侧没有显著性差异（P>0.05）;HIBD生理盐水对照组左右脑半球BrdU阳性细胞数分别为260.88±18.89（（x|-）±s, n=8）和44.38±7.65（（x|-）±s, n=8）,两侧有明显差异（P<0.05）;丹参干预组左右脑半球BrdU+细胞数分别为317.25±22.66（（x|-）±s, n=8）和44.38±7.65（（x|-）±s, n=8）,两侧有显著性差异（P<0.05）;三组间左右脑内BrdU+细胞数均有明显差异（P<0.05）,三组间全脑BrdU+细胞数分别为430.50±25.12（（x|-）±s, n=8）,335.75±24.12（（x|-）±s, n=8）,361.63±27.02（（x|-）±s, n=8）,三组间均具有显著性差异（P<0.05）。假手术组中左、右脑内BrdU+细胞数占全脑比例分别为0.50±0.02（（x|-）±s, n=8）和0.50±0.02（（x|-）±s, n=8）,无显著性差异（P>0.05）;生理盐水对照组中左、右脑内BrdU+细胞数占全脑比例分别为0.22±0.03（±s, n=8）和0.78±0.03（（x|-）±s, n=8）,具显著性差异（P<0.05）;丹参干预组中左、右脑内BrdU+细胞数占全脑比例分别为0.12±0.01（（x|-）±s, n=8）和0.88±0.01（（x|-）±s, n=8）,具显著性差异（P<0.05）。假手术组BrdU+细胞Nestin、GFAP、TUJ-1的表达率分别为（77.75±5.65）%（（x|-）±s, n=8）,（12.17±3.32）%（（x|-）±s, n=8）,（4.14±1.36）%（（x|-）±s, n=8）,HIE生理盐水对照组BrdU阳性细胞Nestin、GFAP、TUJ-1的表达率分别为（63.19±5.37）%（（x|-）±s, n=8）,（19.75±3.49）%（（x|-）±s, n=8）,（8.12±2.01）%（（x|-）±s, n=8）,HIBD丹参干预组BrduU+细胞Nestin、GFAP、TUJ-1的表达率分别为（44.81±5.02）%（（x|-）±s, n=8）,（23.93±2.88）%（（x|-）±s-, n=8）,（22.12±2.50）%（（x|-）±s, n=8）,三组间三种蛋白表达率均具显著性差异（P<0.05）。结论丹参可以保护脑组织免遭缺氧缺血的进一步脑损害,并可促进脑内BrdU+细胞迁移至脑坏死区,并提高其神经性分化率。目的探寻骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic ischemic brain damage, HIBD）的最佳时间点。方法建立新生鼠缺氧缺血性脑病（ Hypoxic ischemic encephalopathy, HIE）动物模型,在新生鼠发生HIBD后4个时间点（2 h,24 h,3 d,6 d）处死动物迅速取脑,去除嗅球及小脑部分进行匀浆,酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测匀浆上清液中碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）含量,相应日龄的假手术组大鼠作为对照。选取4～5代状态好的MSC对发生HIBD后2 h、24 h、3 d、6 d的新生鼠进行腹腔注射移植,4周后进行水迷宫行为学检测。结果ELISA检测结果显示HIBD模型组在发生HIBD后2 h、24 h、3 d、6 d 4个时间点脑组织bFGF的含量分别为（pg/ml）:66.25±36.13 （（x|-）±s, n=8）、71.25±31.88 （（x|-）±s, n=8）、113.13±31.41 （（x|-）±s, n=8）、105.63±43.28 （（x|-）±s, n=8）,各时间点比较无显著性差异（p>0.05）,仍呈上升趋势。假手术组对应的时间点脑组织bFGF的含量分别为（pg/ml）:214.38±37.03 （（x|-）±s, n=8）,131.25±32.50 （（x|-）±s, n=8）,99.38±40.47 （（x|-）±s, n=8）,96.25±49.06 （（x|-）±s, n=8）,呈逐渐下降的趋势,其中对应的2 h组明显高于其他各个时间点（p<0.05）。MSC移植4周后水迷宫检测结果显示:在定位航行实验中HIBD后2 h移植组（A组）、HIBD后24 h移植组（B组）、HIBD后3 d移植组（C组）、HIBD后6 h移植组（D组）、假手术组（E组）、HIBD空白对照组（F组）逃避潜伏时间分别为（s）:18.29±3.10 （（x|-）±s, n=8）、46.63±6.48 （（x|-）±s, n=8）、44.28±6.09 （（x|-）±s-, n=8）、22.07±4.39 （（x|-）±s, n=8）、16.22±3.14 （（x|-）±s, n=8）、67.49±4.15 （（x|-）±s, n=8）,E组及各移植组逃避潜伏时间均明显低于F组（p<0.05）,A组与E组比较无明显差别（p>0.05）,且明显低于其它各组（p<0.05）,D组逃避潜伏时间明显低于B组、C组（p<0.05）,B组与C组无明显差异（p>0.05）;在空间探索实验中A组、B组、C组,D组、E组、F组的平台象限泳距占总泳距的比例分别为:0.57±0.04 （（x|-）±s, n=8）、0.43±0.03 （（x|-）±s, n=8）、0.41±0.03 （（x|-）±s, n=8）、0.55±0.03 （（x|-）±s, n=8）、0.60±0.04 （（x|-）±s, n=8）、0.30±0.02 （（x|-）±s, n=8）,E组及各移植组的平台象限泳距占总泳距的比例均明显高于F组（p<0.05）,A组与E组及D组比较无明显差别（p>0.05）,D组明显低于E组（p<0.05）,而明显高于B组和C组（p<0.05）,B组与C组无明显差异（p>0.05）。结论MSC移植可明显改善HIBD大鼠的空间学习记忆功能,本研究中在HIBD后2 h进行移植效果较其它时间点移植好。目的探讨丹参是否能提高骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）移植后神经性分化效率,移植分化后的细胞是否具有神经突触循环功能,MSC移植后是否可促进内源性神经干细胞（Neural stem cells, NSC）的分化。方法对6日龄新生大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶（5-bromo-2 -deoxyuridine, BrdU）以标记内源性NSC,于7日龄时制备为缺氧缺血性脑病（Hypoxic ischemic encephalopathy, HIE）动物模型,体外培养MSC,选取4～5代状态好的MSC用DAPI进行标记,于新生鼠发生HIBD后2 h进行腹腔注射移植。移植4周后进行Morris水迷宫学习记忆功能检测,水迷宫检测结束后BrdU/DAPI/Nestin,BrdU/DAPI/TUJ1,BrdU/DAPI/GFAP组织免疫荧光三标检测BrdU+细胞分化效率以及MSC分化效率,同时对移植分化后的细胞神经突触循环功能进行检测。结果MSC移植4周后Morris水迷宫检测结果显示:在定位航行实验中假手术正常对照组（A组）,HIBD后2 h接受MSC移植治疗,并于24h后接受丹参干预组（B组）,HIBD后2 h接受MSC移植治疗,并于24h后PBS对照干预组（C组）,HIBD后2 h接受丹参干预,并同时接受MSC移植治疗组（D组）,HIBD后2h接受丹参干预组（E组）,HIE空白对照组（F组）逃避潜伏时间分别为（s）:18.16±1.90 （（x|-）±s, n=8）、19.43±2.07、22.84±1.97 （（x|-）±s, n=8）、31.05±4.09 （（x|-）±s, n=8）、33.60±3.30 （（x|-）±s, n=8）、60.63±5.66 （（x|-）±s, n=8）,A组逃避潜伏时间明显低于C组、D组、E组、F组,P<0.05,与B组比较无明显差异,P>0.05;B组逃避潜伏时间明显低于D组、E组、F组,P<0.05;C组与A组、D组、E组、F组比较具有显著性差异,P<0.05,与B组无明显差异,P>0.05;D组与A组、B组、C组、F组比较具有显著性差异,P<0.05,与F组无明显差异,P>0.05;E组与A组、B组、C组、F组比较具有显著性差异,P<0.05;F组逃避潜伏时间明显高于其它各组,P<0.05。在空间探索实验中A组、B组、C组,D组、E组、F组的平台象限泳距占总泳距的比例分别为: 0.62±0.03 （（x|-）±s, n=8）、0.63±0.04 （（x|-）±s, n=8）、0.57±0.07 （（x|-）±s, n=8）、0.48±0.03 （（x|-）±s, n=8）、0.45±0.02 （（x|-）±s, n=8）、0.31±0.03 （（x|-）±s, n=8）,A组和B组平台象限泳距占总泳距的比例明显高于其他各组,P<0.05,A组与B组间无明显差异,P>0.05;C组平台象限泳距占总泳距的比例明显高于D组和E组,P<0.05;D组与E组间无明显差异,P>0.05,但明显高于F组,P<0.05。脑组织免疫荧光三标结果显示:A组、B组、C组,D组、E组、F组中BrdU+细胞Nestin表达率分别为（%）:78.04±6.03 （（x|-）±s, n=8）、23.43±3.57 （（x|-）±s, n=8）、33.73±3.69 （（x|-）±s, n=8）、43.01±5.45 （（x|-）±s, n=8）、48.59±5.45 （（x|-）±s, n=8）、65.63±7.20 （（x|-）±s, n=8）,B组BrdU+细胞Nestin的表达明显低于其他各组,P<0.05;A组与F组明显高于其他各组,P<0.05,F组明显低于A组,P<0.05; C组明显低于A组、D组、E组、F组,P<0.05;D组和E组间无显著性差异,P>0.05;A组、B组、C组,D组、E组、F组中BrdU+细胞GFAP表达率分别为（%）:11.71±3.28 （（x|-）±s, n=8）、26.85±3.22 （（x|-）±s, n=8）、24.87±3.17 （（x|-）±s, n=8）、23.62±2.74 （（x|-）±s, n=8）、21.70±3.08 （（x|-）±s, n=8）、18.27±3.86 （（x|-）±s, n=8）,B组、C组、D组、E组、F组BrdU+细胞GFAP表达率均较A组明显升高, P<0.05;A组、B组、C组,D组、E组、F组中BrdU+细胞TUJ1表达率分别为（%）:4.68±1.67 （（x|-）±s, n=8）、35.04±3.65 （（x|-）±s, n=8）、27.48±4.25 （（x|-）±s, n=8）、22.61±2.74 （（x|-）±s-, n=8）、19.18±1.96 （（x|-）±s, n=8）、7.72±2.10 （（x|-）±s, n=8）,各组间BrdU+细胞TUJ1表达率比较均有显著性差异,P<0.05,B组>C组>D组>E组>F组>A组。B组、C组,D组MSC的TUJ1表达率分别为:0.59±0.07 （（x|-）±s, n=8）、0.28±0.07 （（x|-）±s, n=8）、0.23±0.03 （（x|-）±s, n=8）,各组间均具有显著性差异,P<0.05,B组>C组>D组,GFAP的表达率分别为:0.12±0.03 （（x|-）±s, n=8）、0.23±0.04 （（x|-）±s, n=8）、0.17±0.03 （（x|-）±s, n=8）,各组组间两两比较具有显著性差异,P<0.05,C组>D组>B组,Nestin的表达率分别为:0.12±0.04 （（x|-）±s, n=8）、0.23±0.06 （（x|-）±s, n=8）、0.23±0.04 （（x|-）±s, n=8）,B明显低于C组和D组,P<0.05,C组与D组间无明显差,P>0.05。MSC移植入HIBD新生鼠脑内5周后,突触循环检测结果显示:脑组织片第1次受到含10μM SynaptoRed-C2荧光探针的50 mM K+刺激后,细胞发生胞吞作用而发出红色荧光,当再次受50 mM K+刺激后,细胞荧光强度降低。胞具有正常的突触循环功能,MSC的移植还可促进BrdU+细胞神经性分化。
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