鹅和番鸭细小病毒VP3-ELISA诊断方法的建立

论文摘要

l-3周龄雏番鸭鹅细小病毒病或番鸭细小病毒病也叫“三周病”。雏番鸭常因感染该病毒而发病死亡或康复后变为僵鸭,严重制约了我国番鸭养殖业的发展,给我国的番鸭养殖业造成了巨大的经济损失。鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV） ,二者均属于细小病毒科细小病毒属成员,基因组为单股线性DNA。目前,针对GPV或MDPV抗原和抗体的诊断方法有琼脂扩散试验、病毒中和试验、Western blot分析、传统ELISA、噬斑中和试验、间接免疫荧光和聚合酶链式反应。传统ELISA血清学诊断方法已用于GPV感染,但是全病毒的纯化需要大量病毒的培养,其过程繁琐且成本高。目前需要一种快速、简便的方法以诊断GPV或MDPV感染。另外,GPV或MDPV免疫后的水禽母源抗体滴度也需要检测以判断其后代能否具有足够的保护力。而原核表达蛋白的成本低,并且易于通过亲和层析或洗脱纯化。目前,国内外多种应用原核表达蛋白作为包被抗原的ELISA抗体检测方法已被广泛应用。VP3蛋白在3种核衣壳蛋白中是含量最多,且在GPV或MDPV感染的水禽体内能诱导中和抗体的产生。因此,VP3是检测GPV或MDPV抗体最合适的候选蛋白。本研究VP3-ELISA诊断方法的建立,为水禽细小病毒感染的诊断、免疫后抗体和母源抗体水平检测、细小病毒流行病学调查以及基因工程疫苗的研究提供了一种简便、灵敏、快速和可靠的血清学诊断方法。本研究以纯化的鹅细小病毒（GPV）重组VP3蛋白为包被抗原,建立了检测雏番鸭水禽细小病毒抗体的间接ELISA方法;通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为5μg/mL;待检血清稀释倍数为1:160,作用时间为1 h;辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸭二抗稀释倍数为1:400,作用时间为1 h;底物作用时间为25 min;阳性判定标准为OD450 nm≥0.34。特异性实验和敏感性实验结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性;板间、板内重复试验变异系数均小于10%,显示该方法具有良好的可重复性;初步应用于血清中水禽细小病毒抗体的检测,其敏感性高于琼脂扩散试验,与中和试验结果基本一致,符合率为84%。稳定性试验结果表明:4℃、-20℃和-70℃分别保存九个月仍有很好的检测效果,4℃冰箱保存的效果相对较好,为今后水禽细小病毒病VP3-ELISA血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 水禽细小病毒病简介
• 1.2 水禽细小病毒的特性
• 1.2.1 形态特点和理化特性
• 1.2.2 基因组结构与功能
• 1.2.3 病毒结构蛋白及其功能
• 1.2.4 水禽细小病毒致病性与病毒培养
• 1.2.5 抗原性分析
• 1.3 水禽细小病毒诊断方法的研究进展
• 1.3.1 病毒的分离和鉴定
• 1.3.2 病毒的电境观察
• 1.3.3 病毒的血清学鉴定
• 1.3.4 病毒的分子生物学鉴定
• 1.4 水禽细小病毒病的预防
• 1.5 ELISA 诊断方法的研究进展
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 GPV VP3 蛋白的原核表达、纯化、定量和 Western blot 分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株、质粒和血清
• 2.1.2 工具酶和主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 GPV VP3 蛋白的表达
• 2.1.5 重组蛋白pET30a-VP3 的SDS-PAGE 电泳分析
• 2.1.6 重组蛋白pET30a-VP3 的纯化
• 2.1.7 重组蛋白pET30a-VP3 的定量和保存
• 2.1.8 重组蛋白pET30a-VP3 的Western blot 分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组蛋白pET30a-VP3 的表达、纯化
• 2.2.2 重组蛋白pET30a-VP3 的定量
• 2.2.3 重组蛋白pET30a-VP3 的Western blot 分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 原核表达重组蛋白的纯化
• 2.3.2 纯化重组蛋白的免疫活性
• 2.4 小结
• 第三章 水禽细小病毒VP3-ELISA 的建立和评价
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 毒株、血清和禽胚
• 3.1.2 工具酶和主要试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.1.4 间接ELISA 操作程序
• 3.1.5 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
• 3.1.6 封闭时间的确定
• 3.1.7 待检血清最佳作用时间的确定
• 3.1.8 酶标抗体工作浓度与作用时间的确定
• 3.1.9 底物显色时间确定实验
• 3.1.10 阴阳性判定标准的确定
• 3.1.11 特异性试验
• 3.1.12 敏感性实验
• 3.1.13 重复性试验
• 3.1.14 血清样品的检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
• 3.2.2 封闭时间的确定
• 3.2.3 待检血清最适作用时间的确定
• 3.2.4 酶标抗体工作浓度与作用时间的确定
• 3.2.5 底物显色时间确定实验
• 3.2.6 阴阳性判定标准的确定
• 3.2.7 特异性试验
• 3.2.8 敏感性实验
• 3.2.9 重复性试验
• 3.2.10 血清样品的检测
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 稳定性试验
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 血清
• 4.1.2 工具酶和主要试剂
• 4.1.3 仪器设备
• 4.1.4 试验设计
• 4.2 结果
• 4.2.1 新包被 ELISA 板检测结果
• 4.2.2 保存三个月检测结果
• 4.2.3 保存六个月检测结果
• 4.2.4 保存九个月检测结果
• 4.2.5 综合分析保存效果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历