论文摘要
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。在很多发达国家中,肺癌在男性常见肿瘤中占首位,在女性常见肿瘤中占第二或三位。近半个世纪以来,世界各国肺癌的发病率与死亡率都急剧上升,我国也不例外。据调查表明,在我国肺癌的发病率城市高于农村;在北京、上海、天津等城市肺癌已占恶性肿瘤发病率的首位。我国肺癌死亡率有上升趋势,对于这一发病率日益增长的肿瘤,尽管投入了大量的人力物力进行研究,但令人遗憾的是,治疗效果一直不尽人意。近年来,随着膜片钳技术和分子生物学技术的进展,以及在肿瘤细胞膜离子通道研究中的应用,肿瘤细胞膜离子通道的研究已成为新的潮流,离子通道是细胞膜上的跨膜蛋白质分子,是一种具有选择性的允许适当电荷离子通过的亲水性微孔道,联系着细胞内部和外部环境。研究发现,离子通道与肿瘤有密切关系,而钾离子通道是细胞膜上分布最广、类型最多的一类离子通道,发挥许多重要的生物功能,是作为抗肿瘤药物的重要靶点。自从1976年Erwin Nether和Bert Sakmann建立膜片钳（patch clamp）技术、离子通道,特别是心肌平滑肌细胞离子通道研究快速发展起来,深入研究细胞膜离子通道改变在恶性肿瘤发生、发展、侵袭和转移中的作用越来越受到人们的重视。现有的研究表明肺癌相关基因的表达、缺失或突变常常是通过细胞膜信号传导系统和细胞膜离子通道实现的。近年来的研究发现细胞膜离子通道在细胞癌变、侵袭和转移相关信号传导、基因表达等方面亦起十分重要的作用,在细胞癌变、侵袭和转移过程中常伴有细胞膜离子通道结构和功能的异常。1999年,Yao等报道在结肠癌传代细胞膜上有一种电压门控性钾通道表达异常;1999年,Klimatcheva等报道在乳腺癌细胞膜上有钾通道表达异常;另有报道在研究神经纤维瘤、垂体瘤等细胞膜电位时,记录到一种新型的内向整流钾电流。迄今,有关肺鳞癌细胞膜钾通道的研究,尚未见到相关报道,本研究通过观察人肺鳞癌A2细胞膜电压门控性K+电流的特性及钾通道阻断剂四乙胺（TEA）对鳞癌细胞K+电流和细胞增殖的影响,探讨应用钾通道阻断剂抑制肺鳞癌细胞增殖的可行性,为该领域的进一步研究奠定基础。方法:采用肺鳞癌细胞株A2为研究对象,培养24h-72h后,选择单个贴壁良好、立体感光强、折光性较好、单个排列和表面光滑的细胞备用。1.细胞电生理实验:用全细胞膜片钳技术记录细胞膜离子通道特性。将微推进器推进微管电极尖端贴至细胞膜,负压抽吸形成高阻封接,并吸破细胞膜形成全细胞膜片;采用逐步去极化诱发出鳞癌A2细胞的外向钾离子电流,然后将5mmol/L的TEA加至细胞浴液中,记录TEA对K+电流的影响。2.细胞体外增殖实验:用四甲基偶氮唑盐比色试验（MTT法）检测1、2、5和10mmol/L的TEA分别作用细胞12h、24h、36h和48h,然后在570nm波长下用酶联检测吸光度值（A）,比较不同TEA组对细胞增殖的影响。3.用Hoechst33258染色检测细胞凋亡的形态学改变结果:1.全细胞膜片钳记录模式下,采用电压钳制方式,使A2细胞在测试电压范围为-40至+80mV,保持电压为-70mV时,刺激时间为500ms,随着测试电压的增大,钾离子电流幅值也增加,说明其具有电压依赖性。2.记录到A2细胞膜离子电流后,用加药装置将K+通道阻断剂TEA加到浴液,在相同保持电压和测试方案下观察该离子电流的变化。结果当加入浴液5mmol/L的TEA后,可见跨膜离子电流峰值明显降低。3.MTT实验结果显示,TEA对A2细胞增殖的抑制作用具有时间和剂量相关的特点,当TEA浓度≥2mmol/L时,对A2细胞增殖抑制效应明显。4.经Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察,5mmol/L TEA作用48h后,可见具有凋亡形态特征的A2细胞。结论:1.人肺鳞癌A2细胞膜上存在钾离子通道。该通道特性:①离子电流随测试电压的增大而增大,其具有电压依赖性;②肺鳞癌A2细胞膜钾离子通道最大钾电流密度为112.35±7.53pA/pF③鳞癌细胞膜电容为14.13±0.45pF。2.在不同测试电压下,肺鳞癌A2细胞膜上钾离子电流随着钾离子通道阻断剂TEA的加入,其电流值明显减小,说明钾离子电流对TEA敏感。3.钾离子通道阻断剂TEA能抑制人肺鳞癌A2细胞的增殖,且鳞癌A2细胞的增殖抑制与TEA之间存在剂量和时效的依赖关系。4.钾离子通道阻断剂TEA通过阻断电压门控性钾离子通道,从而可诱导肺鳞癌A2细胞的凋亡。