深海热液区嗜热菌噬菌体D6E的分子特征及GVE2与宿主的蛋白质互作研究

论文摘要

海洋占整个地球表面积的71％，多样性的生态环境蕴藏着丰富的生物资源。深海热液口是地球上一个极其恶劣的生存环境-高温、高压、缺氧、含有大量有毒的化学物质，但是其中及其周围却存在着一个完整的生态系统。噬菌体被认为是地球上最丰富的生命体，几乎可以在地球上的每个生态环境中找到，同样也暗示着它们在微生物多样性和生态平衡上发挥着重要作用。嗜热菌作为深海热液口生态群落的初级生产者，是推动营养和能量循环的主要动力。噬菌体是一类特殊群体，它们寄生在细菌体内，根据环境变化发生溶原或者裂解，从而引起宿主菌在整个生态群落中的分布。由于深海热液口在地理分布上具有一定的独立性，所以噬菌体与宿主的关系直接影响着整个热液口生态群落的存在和结构。随着基因组测序技术的发展，越来越多的噬菌体基因组信息添加到基因组数据库中，这为噬菌体生物信息学研究提供了大量的数据，不仅包括噬菌体序列之间的分析，还有利于研究噬菌体群体之间的结构组成。噬菌体的基因组虽然很小，但是却编码了自身复制所需的蛋白，如DNA包装蛋白、头尾结构蛋白、DNA复制相关蛋白、转录调控蛋白、裂解相关蛋白等。通过比较基因组学，可以得到大量的基因多样性数据，同时发现基因组之间存在着非常明显的序列相似性。这些序列可以通过同源或者点特异性重组促进噬菌体基因模块发生互换；或者，通过非定向的遍及整个基因组发生非同源重组。在本论文中，通过各种筛选培养基对深海热液区样品中的嗜热菌和高温噬菌体进行了分离、纯化，并得到了4株高温噬菌体，对其中的高温噬菌体D6E进行了进一步研究。结果表明，高温噬菌体D6E为肌尾科病毒，有二十面体的头部，长长的尾巴和尾丝。经测序，D6E基因组有49335 bp，为双链环状DNA，可以编码49个预测有功能的蛋白。和其它噬菌体一样，D6E的基因排列也是成簇分布的，按功能可以分为四个部分：DNA包装和头部装配、尾部组成、溶原与裂解、DNA复制和转录。通过在NCBI数据库中进行比对分析发现，D6E的大部分结构相关蛋白与已知噬菌体蛋白的同源性非常低，但是溶原和裂解相关基因以及DNA复制和转录相关基因的核苷酸序列与本实验室另外一株已测序的高温噬菌体GVE2不管在基因排列、还是这些基因编码的氨基酸序列上都具有非常高的相似性。采用蛋白质组学技术，对D6E病毒粒子的蛋白质组进行了分析，结果得到了10个与结构相关的蛋白，包括核衣壳蛋白、入口蛋白、支架蛋白等，其中质谱匹配率非常高的两个未知蛋白ORF3（第3条带）和ORF16（第9条带）的功能有待进一步研究。根据本实验室分离获得的深海嗜热菌噬菌体GVE2基因组测序结果和预测阅读框分析，重组表达并纯化了20个GVE2蛋白，制备相应的多克隆抗体，采用Western Blot对噬菌体的基因表达进行了分析。通过免疫共沉淀（Co-IP）和GST下拉（GST pull-down）试验寻找在感染过程中GVE2与宿主可能发生相互作用的蛋白。通过实验，得到了两种蛋白复合体：与GVE2 ORF5（核衣壳蛋白，VP371蛋白）相互作用的分子伴侣蛋白；与GV2 ORF36相互作用的未知蛋白。本实验室前期工作中发现宿主的天冬氨酸转氨酶和分子伴侣蛋白参与了噬菌体的感染过程，因此，本试验进一步研究噬菌体GVE2 VP371蛋白与宿主天冬氨酸转氨酶和分子伴侣形成的蛋白复合体在噬菌体感染中的作用。Western blot和细菌双杂交试验结果显示，VP371蛋白和分子伴侣蛋白之间、分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶之间存在相互作用，而VP371蛋白和天冬氨酸转氨酶之间没有相互作用，复合体中3个蛋白呈串联结构结合在一起。在噬菌体感染实验中我们发现，随着感染时间的增加，VP371的转录表达量逐渐增大，同时分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶都比未感染时有了明显上调表达。因此，在噬菌体感染过程中，GVE2核衣壳蛋白VP371和宿主的分子伴侣蛋白发生相互作用，并依次递进促进了分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶的上调表达，从而进一步调控了宿主细胞的代谢活动。本论文对对高温噬菌体GVE2的ORF3（入口蛋白）和ORF56（胸腺嘧啶合成酶）进行了功能鉴定。ORF3预测为噬菌体入口蛋白，虽然在氨基酸序列上它与其他噬菌体具有很低的同源性，但与SPP1、HK97的入口蛋白都具有相似的螺旋／折叠排列结构，属于HK97入口蛋白家族，在DNA包装过程中发挥着相同的功能。预测二级结构分析发现，GVE2同SPP1和Phi29都具有非常保守的α-Helices，可能是在基因组包装过程中保留下来的一种古老结构域。通过免疫电镜定位，结果表明入口蛋白位于头尾的连接处。Orf56编码原核型的胸腺嘧啶合成酶，与已知的不同物种的胸腺嘧啶合成酶有很高的相似性。ORF56中可以找到符合胸腺嘧啶合成酶的活性中心的保守序列，还具有五个非常保守的motif，包括叶酸结合位点、催化活性中心、dUMP-结合位点、质子转运位点和功能待定区域。通过体外结合试验，结果发现ORF56编码的蛋白可以与其自身mRNA结合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 嗜热微生物研究的概述
• 1.2 噬菌体概述
• 1.3 噬菌体与宿主相互作用机制的研究
• 1.4 胸腺嘧啶合成酶
• 1.5 入口蛋白的研究进展
• 1.6 本论文的研究目的、内容和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 基本方法
• 3 结果与分析
• 3.1 深海嗜热菌噬菌体的分离纯化、基因组及蛋白质组分析
• 3.1.1 嗜热菌的筛选与鉴定
• 3.1.2 深海高温噬菌体D6E的分离纯化、基因组及蛋白质组分析
• 3.2 深海高温噬菌体GVE2与宿主的蛋白质互作研究
• 3.2.1 深海高温噬菌体GVE2开放阅读框（ORF）的重组表达
• 3.2.2 深海高温噬菌体GVE2 ORF的表达分析
• 3.2.3 深海高温噬菌体GVE2与宿主互作蛋白的筛选
• 3.2.4 深海高温噬菌体GVE2感染相关复合体的研究
• 3.2.5 深海高温噬菌体GVE2 ORF的功能研究
• 4 讨论
• 4.1 深海热液口高温噬菌体的筛选与鉴定
• 4.2 高温噬菌体VGE2与宿主之间相互作用的研究
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 6 参考文献
• 7 附录
• 致谢