包埋玻璃化法超低温保存裙带菜雌、雄配子体的研究

论文摘要

内容摘要:液氮超低温保存是目前植物种质资源长期保存的理想方法。本文综述了近十年来超低温保存植物材料所取得的主要成果。近些年来,由于对海洋生物的资源开发,藻类在我们的生产和生活中扮演着越来越重要的角色,它们在生物技术上的潜力与日俱增,因此,藻类种质超低温保存的研究日益受到重视。国内外对藻类种质资源超低温保存的方法也有了相当的研究,其中,包埋-玻璃化法是20世纪90年代在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的新技术。与常规的两步法和包埋脱水法相比,包埋玻璃化法具有操作简单、重演性好、能同时处理大量材料等优点,在藻类种质保存中有广阔的应用前景。本文首次以裙带菜雌、雄配子体为试验材料,用包埋玻璃化法进行超低温保存。首先将裙带菜配子体包埋在含有30‰氯化钠的3%褐藻酸钙的胶球中,在暗处恢复培养1d,光下恢复3d后,用装载液装载,再用100%玻璃化溶液（plant vitrification solution,PVS）进行脱水处理,冻存1h后,取出装有样品的冻存管,并迅速投入40 oC恒温水浴中,快速化冻约2min,化冻后样品经洗涤液洗涤后用于存活率测定。探讨了装载液成分,装载时间,玻璃化溶液成分,脱水时间,洗涤液成分及洗涤时间对裙带菜雌、雄配子体超低温保存的影响。结果表明:1、裙带菜雌配子体:25℃2M甘油+0.6M蔗糖装载120min,0℃PVS2脱水50min,1.2M蔗糖溶液洗涤两次,每次10min的条件下,裙带菜雌配子体保存后的存活率最高,为31%。2、裙带菜雄配子体:25℃2M甘油+0.6M蔗糖装载90min,0℃PVS2脱水40min,1.2M蔗糖溶液洗涤两次,每次10min的条件下,裙带菜雄配子体保存后的存活率最高,为26%。本实验将裙带菜雌、雄配子体分开进行纯化和超低温保存,有利于育种的需要,而且超低温保存后的雌、雄配子体具有完全的再生能力,能够正常地发育成孢子体。本实验首次采用包埋玻璃化法保存裙带菜配子体,大大地简化了超低温保存程序,为长期保存裙带菜种质资源提供了新途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第1章 植物和藻类种质超低温保存的研究综述
• 1.1 低温生物学
• 1.1.1 低温生物学的定义及范畴
• 1.1.2 低温生物学的发展
• 1.1.3 低温生物学应用于生物材料保存的意义
• 1.1.4 超低温保存技术
• 1.1.4.1 超低温定义
• 1.1.4.2 超低温研究简史
• 1.1.4.3 超低温保存的理论基础
• 1.1.4.3.1 阿赫尼乌斯理论
• 1.1.4.3.2 细胞冰冻伤害机制
• 1.1.4.4 超低温研究意义及优点
• 1.2 植物种质超低温保存的研究
• 1.2.1 植物种质超低温保存的目的和意义
• 1.2.2 植物种质超低温保存的原理及理论基础
• 1.2.3 植物种质超低温保存方法
• 1.2.3.1 一步法（One step freezing）
• 1.2.3.2 控速冷冻法（Controlled rate freezing）
• 1.2.3.3 玻璃化法（Vitrification）
• 1.2.3.3.1 玻璃化保存的两种方式
• 1.2.3.3.2 玻璃化溶液
• 1.2.3.3.3 玻璃化法保存程序
• 1.2.3.4 包埋（胶囊化）- 脱水法（Encapsulation - dehydration）
• 1.2.3.4.1 样品包埋
• 1.2.3.4.2 脱水处理
• 1.2.3.5 玻璃化法与包埋法的结合
• 1.2.3.5.1 包埋玻璃化保存方法
• 1.2.3.5.1.1 样品包埋
• 1.2.3.5.1.2 装载
• 1.2.3.5.1.3 玻璃化保护液脱水
• 1.2.3.5.1.4 冻存
• 1.2.3.5.1.5 化冻与洗涤
• 1.2.3.5.1.6 包埋玻璃化保存方法的保存程序
• 1.2.3.5.2 包埋玻璃化技术的优点
• 1.3 藻类种质超低温保存的研究进展
• 1.3.1 藻类种质超低温保存的目的和意义
• 1.3.2 藻类种质超低温保存的研究进展
• 1.3.2.1 国外主要研究进展和成果
• 1.3.2.2 国内主要研究进展和成果
• 第2章 包埋玻璃化法超低温保存裙带菜雌、雄配子体的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料来源及其培养
• 2.1.2 主要仪器设备和主要试剂的配制
• 2.1.2.1 主要仪器设备
• 2.1.2.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 方法
• 2.1.3.1 包埋
• 2.1.3.2 装载
• 2.1.3.3 脱水
• 2.1.3.4 冻存
• 2.1.3.5 化冻和洗涤
• 2.1.3.6 恢复培养及存活率的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 装载液配方对裙带菜配子体超低温保存存活率的影响
• 2.2.2 装载时间对裙带菜配子体超低温保存存活率的影响
• 2.2.3 PVS 配方对裙带菜配子体超低温保存存活率的影响
• 2.2.4 脱水时间对裙带菜配子体超低温保存存活率的影响
• 2.2.5 洗涤液配方和洗涤时间对裙带菜配子体超低温保存存活率的影响
• 2.2.6 裙带菜配子体超低温保存后发育能力的观测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 装载
• 2.3.2 脱水
• 2.3.3 洗涤
• 2.4 结论
• 参考文献
• 致谢