大熊猫等濒危动物IGF-Ⅰ基因的克隆、表达与组织分布研究

论文题目: 大熊猫等濒危动物IGF-Ⅰ基因的克隆、表达与组织分布研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 胡细连

导师: 朱睦元

关键词: 基因克隆,濒危动物,大熊猫,小熊猫,东北虎,川金丝猴,组织分布,繁殖率,存活率,胰岛素样生长因子,免疫组化,原位杂交,同源分析,原核表达,进化分析,重组蛋白,纯化

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 野生动物是自然生态环境的重要组成部分,保护野生动物尤其是拯救濒危野生动物,对维持地球生态平衡和保持生物多样性具有重要意义。圈养人工繁殖,是保护濒危动物,增加动物种群数量的重要方法。但在圈养条件下,多数濒危动物繁殖率及幼仔存活率都较低,严重影响了保护野生动物的工作。特别是大熊猫,其生殖能力和育幼能力高度特化,生殖率和幼仔存活率低已成为目前圈养繁殖面临的两大急待解决的问题。 大熊猫幼仔存活率低则与出生幼仔先天发育不全,免疫系统发育尚不完善或是缺少母乳哺育相关。至今关于大熊猫生殖力和幼仔存活率低的分子基础的探索性报道非常少。因此,本研究针对以大熊猫幼仔存活率低、大熊猫成体繁殖率低的主要问题,以大熊猫、小熊猫、金丝猴和东北虎为研究对象,开展了在动物幼仔生长发育和成体繁殖、泌乳过程中均发挥重要作用的胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的基因克隆、序列分析和原核表达、纯化及组织分布的研究,并探讨了今后生物工程生产大熊猫等濒危动物IGF-Ⅰ,用于提高野生动物幼仔的成活率、成体繁殖能力的实践的意义和可能性。主要结果如下: 1.利用RT-PCR技术从大熊猫和小熊猫的肝脏组织分别扩增出大熊猫及小熊猫胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)的编码区序列,这两个序列均编码153个氨基酸的前体蛋白质,预测的分子量为17kD。同源性分析表明IGF-Ⅰ的核苷酸和氨基酸序列与已报道的人、牛、马、羊、鼠等哺乳动物的序列高度同源(>78%)。对位比较发现大熊猫的信号肽和延伸肽序列也具有氨基酸特异性,这些氨基酸是否会影响大熊猫IGF-Ⅰ分子的构型、成熟加工进而影响其功能、或最终引起大熊猫生长发育或繁殖的障碍则有待进一步的研究。在所有被比较的物种中,小熊猫与大熊猫序列同源性最高。在氨基酸序列上仅有一个氨基酸的差异。利用IGF-Ⅰ基因构建的进化树上,大熊猫和小熊猫此基因的同源性达到95%,并且显示小熊猫与大熊猫的亲缘关系与其它哺乳动物相比要近的多,为大熊猫及小熊猫的分类学提供了分子生物学的依据,但这样的结果也许与IGF-Ⅰ在物种间的高度保守性有关,我们认为,对于大小熊猫是否同属一科还需要进一步的研究。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.胰岛素样生长因子(IGFs)系统

1.1 胰岛素样生长因子(IGFs)系统

1.2 IGF-Ⅰ的生物学功能

1.3 IGF-Ⅱ的生物学功能

1.4 IGFBP的调节及生物学功能

1.5 动物胚胎发育过程中IGFs的表达

2.IGF-Ⅰ与其它生长因子和激素的关系

2.1 胰岛素与IGF的关系

2.2 GH与IGF-Ⅰ的关系

2.3 IGF-Ⅰ与IGFBP的关系

2.4 IGF-Ⅰ与LH，FSH的关系

3.大熊猫的研究

3.1 珍稀动物大熊猫介绍

3.2 大熊猫的人工繁殖

3.3 圈养大熊猫的繁育问题

3.4 大熊猫幼仔的育活

3.5 我国大熊猫的保护工作

4.本课题的立论依据及研究内容

4.1 立论依据

4.2 研究内容

第二章 大熊猫IGF-Ⅰ基因的克隆、原核表达、纯化及组织分布研究

前言

1.材料与方法

1.1 实验材料和试剂

1.2 大熊猫IGF-I基因的克隆

1.3 克隆序列的GenBank登录

1.4 GPIGF-I基因在大肠杆菌中的表达

1.5 融合蛋白的免疫学活性检测

1.6 免疫组织化学检测

1.7 原位杂交分析

1.8 光学显微镜拍照

1.9 图像分析

2.结果与分析

2.1 大熊猫IGF-I基因编码框GPIGF-I的克隆

2.2 大熊猫GPIGF-I的测序分析

2.3 大熊猫GPIGF-I的同源性比较分析

2.4 重组表达载体pET-DsbA-GPIGF-I的构建

2.5 重组质粒pET-DsbA-GPIGF-I的克隆和筛选

2.6 pET-DsbA-GPIGF-I的表达分析

2.7 重组表达蛋白的纯化

2.8 重组表达蛋白的免疫原性Western印迹分析

2.9 大熊猫不同组织免疫组化分析

2.10 大熊猫不同组织的原位杂交分析

2.11 IOD值的测量及统计学分析

3.讨论

第三章 小熊猫胰岛素样因子(IGF-I)基因的克隆和原核表达

前言

1.材料、试剂、仪器、方法

2.结果

2.1 总RNA的提取

2.2 PCR产物的扩增

2.3 PCR签定

2.4 小熊猫IGF-I基因编码区序列cDNA的测序

2.5 序列分析

2.6 同源性比较分析

2.7 IGF-I基因在大熊猫、小熊猫及其它物种中的进化分析

2.8 重组表达载体pET-DsbA-RPIGF-I的构建

2.9 重组质粒pET-DsbA-RPIGF-I的克隆和筛选

2.10 pET-DsbA-RPIGF-I的表达分析

2.11 重组表达蛋白的纯化

2.12 重组表达蛋白的免疫原性Western印迹分析

2.13 小熊猫不同组织免疫组化分析

2.14 小熊猫不同组织的原位杂交分析

2.15 IOD值的测量及统计学分析

3.讨论

第四章 川金丝猴和东北虎IGF-I基因的克隆、分析与原核表达

前言

1.材料和材料、试剂、仪器、方法

2.结果与分析

2.1 总RNA提取及RT-PCR的电泳结果

2.2 重组克隆质粒的PCR鉴定

2.3 川金丝猴和东北虎IGF-I基因编码区序列cDNA的测序

2.4 序列分析

2.5 川金丝猴IGF-I的序列

2.6 东北虎的IGF-I的序列

2.7 川金丝猴、东北虎的IGF-I与其它物种间的同源分析

2.8 川金丝猴、东北虎与其它物种间的进化关系

2.9 重组表达载体pET-DsbA-MIGF-I和pET-DsbA-TIGF-I的构建

2.10 重组表达质粒的克隆和筛选

2.11 pET-DsbA-MIGF-I和pET-DsbA-TIGF-I的表达分析

2.12 重组表达蛋白的纯化

2.13 重组表达蛋白的免疫原性Western印迹分析

3.讨论

全文参考文献

致谢

发布时间: 2005-10-10

参考文献

• [1].小相岭大熊猫种群生态学和保护策略研究[D]. 冉江洪.四川大学2004
• [2].大熊猫自然保护区体系研究[D]. 严旬.北京林业大学2005

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