论文摘要
本研究包括两部分内容:第一部分外周血线粒体DNA最佳提取方法探讨目的探讨简便高效提取人外周血线粒体DNA（mtDNA）的方法。方法分别用线粒体DNA提取试剂盒方法、某文献方法和高盐沉淀法提取外周血mtDNA,对三种方法所提取到的mtDNA分别经紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增目的产物电泳分析。结果三种方法所提得mtDNA产量有明显差别,经紫外分光光度检测可得,高盐沉淀法所得mtDNA产量最高,为9.5788±0.3852;文献方法次之,为4.3786±0.1495;试剂盒方法产量最低,为0.7408±0.1801。对所得mtDNA进行琼脂糖凝胶电泳,亦显示高盐沉淀法所得样品条带最亮。以mtDNA为模板进行PCR扩增,均可得533bp大小的目的带,但试剂盒法条带较暗。结论高盐沉淀法提取人外周血细胞中mtDNA的产量高,质量可控,用于PCR扩增所得产物稳定可靠,与其他提取方法比较有较好的应用价值。第二部分人外周血线粒体DNA4977bp缺失与电离辐射的剂量-效应关系研究目的通过对电离辐射诱发的人外周血线粒体DNA（mtDNA）4977bp缺失片断的克隆,探讨辐射诱导的mtDNA4977bp缺失与电离辐射的生物剂量-效应关系。方法选取年龄28岁的1名健康男性,近期无射线接触史,收集外周血20 mL,EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝,平均分成10份,2 mL/份,用本所提供的137铯照射源对外周血样品进行离体照射,吸收剂量率为0.79 Gy/min,照射剂量分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 Gy。另取1位67岁老年男性外周血2 mL作为阳性对照。血样照射后在37℃培养箱中放置2 h后进行线粒体DNA的提取。所得mtDNA产物用巢式PCR方法扩增mtDNA4977bp缺失片断,同时扩增mtDNA序列中相对稳定区域的片断作为内参照,代表总mtDNA的量。通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,并经凝胶图像分析系统获得灰度值,得出mtDNA4977bp缺失片断与代表总mtDNA的片段的灰度比值。结果1、从外周血样品中萃取的白细胞mtDNA的质量较高。2、电离辐射诱发的人外周血线粒体DNA（mtDNA）4977bp缺失片断的大小与理论预期值大小基本一致,在未照射的mtDNA中未能扩增出特异的PCR产物。3用巢式PCR方法扩增得到的mtDNA4977bp缺失目的片断,通过对琼脂糖凝胶电泳图像和灰度值的比较,得出照射剂量在0.2～3.0Gy之间时,灰度比值基本呈增加趋势:而剂量在4.0～10.0Gy之间时,比值变化较大且无规律性。结论1、通过在mtDNA4977bp缺失片断两侧设计引物,用巢式PCR方法扩增得到了电离辐射诱发的跨4977bp缺失的目的DNA片断。2、初步建立了检测mtDNA4977bp缺失片断的半定量PCR分析方法。在相对较低剂量（0.2～3.0Gy）照射时,mtDNA的4977bp缺失的量与受照剂量呈一定相关性,当照射剂量大于4Gy时,这种剂量效应关系较不稳定。表明mtDNA4977bp缺失片断的半定量PCR分析可能在0.2～3Gy照射范围内对辐射生物剂量估算有意义。
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