刺五加细胞培养体系的建立与有效成分积累的调控研究

论文摘要

刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Marxim.）Harms[Eleuthereoccus senticosus（Rupr.et Marxim.）Marxim.]为五加科一种重要的药用木本植物,主要分布在亚洲东北部,五加科五加属植物大多含有五加苷类成分,包括五加苷A,B,C,D,E,F,G等、五加多糖也是其根、叶中的有效成分之一。由于长期人为的过度采挖,刺五加已经被列为渐危植物。本实验利用植物组织和细胞培养技术,以诱导和建立高产的刺五加愈伤组织悬浮培养体系为目的,系统地研究了刺五加愈伤组织的诱导和状态调控,获得了生长均一,长势良好的刺五加愈伤组织;建立了良好的悬浮培养体系,并考察了悬浮体系中刺五加愈伤组织生长规律、刺五加苷、五加多糖和黄酮类的积累规律;利用添加诱导子和高浓度蔗糖渗透胁迫方法,诱导刺五加抗逆反应,提高刺五加苷、五加多糖和黄酮类的合成积累。通过对刺五加两种外植体（叶和叶柄）愈伤组织的诱导,考察了三种不同激素配比的脱分化培养基对刺五加愈伤组织诱导率和愈伤形态的影响,以NAA 2.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1诱导出的愈伤组织最适于悬浮培养,对叶和叶柄的诱导率分别为93.3%和100%。考察了继代培养过程中,光周期和不同激素配比对刺五加愈伤组织状态的影响,筛选出最佳固体继代培养的外源激素配比为NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1;最适光周期为12/12h（光照时间/黑暗时间）;对不同外植体诱导出的愈伤组织进行细胞系的分离,筛选出最适于悬浮培养的细胞系-Ab系。用体积筛选法和限制营养法对刺五加愈伤组织悬浮培养的小细胞团进行了同步化处理,保证了愈伤组织悬浮培养体系的稳定均一,实验结果稳定可靠。针对刺五加原植物的特性和悬浮培养方法的特殊性,初步建立了刺五加悬浮培养体系,确定最适培养基(MS+蔗糖40 g·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1,pH=5.8);最适接种密度(60 g·L-1FW);最适蔗糖初始浓度(40 g·L-1);最适培养振荡器转速（110 rpm）,25±1℃,暗培养。五加愈伤组织悬浮培养的生长周期为40天,最大干重为18.82 g·L-1;刺五加多糖、总皂苷、总黄酮分别在第40天、第16天、第40天达到含量最大值,在五加愈伤组织悬浮培养体系中的产量则同时于第40天达到最大量,分别为1259.25 mg·L-1、398.42 mg·L-1和474.26 mg·L-1。考察了不同蔗糖浓度可显著影响刺五加总多糖和刺五加总皂苷的合成积累,但对黄酮类化合物的合成积累却无明显促进作用;高蔗糖浓度可刺激刺五加总多糖和刺五加总皂苷的合成积累,同时抑制愈伤组织生物量的积累;考察了5种真菌诱导子对刺五加愈伤组织中总黄酮、总苷类、多糖的积累的影响,其中番茄灰霉Botrytis cinerea和真菌2014可显著提高刺五加总苷的含量,分别为32.8 mg·g-1和34.8 mg·g-1,真菌C可明显刺激刺五加多糖的合成积累,为77.25 mg·g-1,培养物的总黄酮含量均明显高于野生药材,为野生药材含量的三倍以上,但除黄瓜炭疽,其他真菌诱导子的添加均导致总黄酮含量的下降;并证实了从刺五加生存环境筛选的真菌作为生物诱导子会刺激其次生代谢并具有特异性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第1章 绪论
• 1.1 刺五加的生物学特性及资源现状
• 1.1.1 刺五加的植物形态
• 1.1.2 刺五加的生存环境
• 1.1.3 刺五加的繁殖特性
• 1.1.4 刺五加资源现状
• 1.2 刺五加的化学成分与药理活性研究进展
• 1.2.1 刺五加的化学成分研究进展
• 1.2.2 刺五加的药理活性研究
• 1.3 刺五加组织培养研究现状
• 1.3.1 刺五加体细胞胚的发生
• 1.3.2 刺五加人工种子的研究
• 1.3.3 刺五加的离体快繁技术
• 1.3.4 刺五加的遗传转化与毛状根培养
• 1.4 立题依据与技术路线
• 第2章 刺五加愈伤组织培养研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 刺五加愈伤组织的诱导
• 2.1.3 刺五加愈伤组织的继代培养
• 2.1.4 刺五加愈伤组织光照周期的确定
• 2.1.5 刺五加愈伤组织继代培养中活性炭的添加
• 2.1.6 刺五加愈伤组织细胞系的筛选和生物量的测定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 不同培养基对刺五加愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2 不同外源激素配比对刺五加愈伤组织继代培养的影响
• 2.2.3 不同光照周期对刺五加愈伤组织生物量积累的影响
• 2.2.4 活性炭对刺五加愈伤组织生物量的影响
• 2.2.5 刺五加愈伤组织细胞系的筛选
• 2.3 结论和讨论
• 2.3.1 培养基及外植体对刺五加愈伤组织诱导的影响
• 2.3.2 外源激素配比对愈伤组织状态的影响
• 2.3.3 光周期比对刺五加愈伤组织生物量积累的影响
• 2.3.4 活性炭对刺五加愈伤组织生长的影响以及培养周期的确定
• 2.3.5 刺五加愈伤组织细胞系的筛选
• 第3章 刺五加悬浮培养体系的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 刺五加悬浮培养愈伤种系的同步化处理
• 3.1.3 刺五加悬浮培养基础培养基的筛选
• 3.1.4 刺五加悬浮培养接种密度的选择
• 3.1.5 刺五加悬浮培养摇床转速的选择
• 3.1.6 刺五加悬浮培养培养基中蔗糖浓度的筛选
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 不同培养基对刺五加愈伤组织悬浮培养生物量的影响
• 3.2.2 不同接种密度对刺五加愈伤组织悬浮培养生物量的影响
• 3.2.3 摇床转速对刺五加愈伤组织悬浮培养生物量的影响
• 3.2.4 培养基中蔗糖浓度对刺五加愈伤组织悬浮培养生物量的影响
• 3.3 结论和讨论
• 3.3.1 悬浮细胞系统同步化处理
• 3.3.2 不同基础培养基对刺五加愈伤组织悬浮培养生物量的影响
• 3.3.3 接种密度对刺五加愈伤组织悬浮培养的影响
• 3.3.4 培养振荡器转速对刺五加愈伤组织悬浮培养的影响
• 3.3.5 培养基中蔗糖浓度对刺五加愈伤组织悬浮培养的影响
• 第4章 刺五加悬浮培养动力学特征研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 刺五加悬浮培养体系生长曲线的绘制和pH值的测定
• 4.1.3 刺五加悬浮培养体系中碳源含量的测定
• 4.1.4 刺五加悬浮培养体系中无机氮含量的测定
• 4.1.5 刺五加悬浮培养体系中无机磷含量的测定
• 4.1.6 刺五加愈伤组织中总皂苷含量的测定
• 4.1.7 刺五加愈伤组织中总多糖含量的测定
• 4.1.8 刺五加愈伤组织中总黄酮含量的测定
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 不同培养时间刺五加悬浮培养生物量及pH值的变化
• 4.2.2 刺五加悬浮培养体系中营养成分消耗动力学
• 4.2.4 刺五加悬浮培养体系中有效成分的积累
• 4.3 结论和讨论
• 4.3.1 刺五加悬浮培养细胞生长动力学
• 4.3.2 刺五加悬浮培养营养物质消耗动力学
• 4.3.3 刺五加愈伤组织悬浮培养产物积累动力学
• 第5章 悬浮培养刺五加愈伤组织中有效成分积累的调控研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 培养基中蔗糖浓度对刺五加愈伤组织有效成分积累的影响
• 5.1.3 真菌诱导子对刺五加愈伤组织有效成分积累的影响
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 培养基中蔗糖浓度对刺五加愈伤组织有效成分积累的影响
• 5.2.2 真菌诱导子对刺五加愈伤组织有效成分积累的影响
• 5.3 结论和讨论
• 5.3.1 蔗糖浓度提供渗透胁迫对刺五加愈伤组织有效成分积累的影响
• 5.3.2 真菌诱导子对刺五加有效产物积累的影响
• 第6章 结论与下一步工作建议
• 6.1 结论
• 6.2 下一步工作建议
• 参考文献
• 附录及缩写说明
• 发表文章目录
• 致谢