选择性雌激素受体调节剂的筛选及其活性评价

论文摘要

雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)是核受体超家族的成员之一,是一类重要的转录调控因子,是治疗乳腺癌、骨质疏松等疾病的重要药物作用靶标。选择性雌激素受体调节剂在治疗ER相关疾病上具有很高的临床应用价值。我们通过计算机虚拟筛选和生物实验相结合的手段来寻找新的选择性ER配体。首先我们采用分子动力学结合虚拟筛选的策略,从商业数据库中搜寻选择性ER配体。通过分子动力学模拟得到ER晶体结构的平均平衡构象作为虚拟筛选的结构基础,然后进行三轮基于分子对接的虚拟筛选,最后确定了70个候选化合物。在活性测试中,我们利用ER与其共激活因子的相互作用构建了酵母双杂交系统,通过检测报告基因活性的方式评价待测化合物的活性和作用类型。结果发现,在这70个化合物中至少有18个表现出良好的ER配体活性。其中有两个双效配体：同时表现为ERa拮抗剂及ERp激动剂；还有11个ER激动剂和5个ER拮抗剂,且不少化合物表现出较高的ER亚型选择性。通过细胞转染和报告基因检测实验,我们验证了这些化合物在细胞水平上能够改变ER的转录激活活性。MTT实验表明,具有ER拮抗活性的化合物能够抑制乳腺癌细胞增殖。我们还较深入地探讨了ER拮抗剂JB042对乳腺癌细胞的生长抑制作用。通过western blot和流式细胞周期分析实验,发现JB042可以下调雌二醇诱导的雌激素效应基因cyclin D1的表达,并将细胞周期阻滞于G1期,最终抑制癌细胞增殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 ER的发现
• 1.2 ER的结构
• 1.3 ER的转录活性
• 1.3.1 依赖配体的经典途径
• 1.3.2 不依赖配体的信号转导途径
• 1.3.3 细胞膜上雌激素受体引导的信号转导途径
• 1.4 雌激素受体与疾病
• 1.4.1 雌激素受体与乳腺癌
• 1.4.2 雌激素受体与前列腺癌
• 1.4.3 雌激素受体与结肠癌
• 1.4.4 雌激素受体与骨质疏松
• 1.5 选择性雌激素受体调节剂
• 1.5.1 他莫昔芬
• 1.5.2 雷洛昔芬
• 1.5.3 托瑞米芬
• 1.5.4 ER亚型选择性SERM
• 1.5.5 新型SERM
• 1.5.6 植物雌激素
• 1.6 雌激素受体配体的筛选方法
• 1.6.1 计算机虚拟筛选
• 1.6.2 受体结合实验
• 1.6.3 ER与辅因子相互作用分析
• 1.6.4 受体转录活性测定
• 1.6.5 体内受体结合实验
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、质粒和细胞株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 常规的实验溶液及实验方法
• 2.2.1 培养基配制
• 2.2.2 常用溶液配制
• 2.2.3 常规方法
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 计算机虚拟筛选
• 2.3.2 重组质粒的构建
• 2.3.3 酵母双杂交系统的构建
• 2.3.4 利用Y2H测定化合物活性—药物作用及α-gal活性测定
• 2.3.5 细胞培养
• 2.3.6 细胞转染
• 2.3.7 Luciferase检测
• 2.3.8 MTT
• 2.3.9 Western Blot
• 2.3.10 流式细胞仪检测细胞周期
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 虚拟筛选
• 3.2 酵母双杂交系统的构建
• 3.3 酵母双杂交系统测试结果
• 3.4 化合物的对接构象分析
• 3.5 ER配体影响ER的转录激活活性
• 3.6 乳腺癌细胞增殖抑制
• 3.7 JB042下调雌激素诱导的cyclin D1的表达
• 3.8 JB042将细胞周期阻滞于G1期
• 第4章 结论
• 参考文献
• 致谢