论文摘要
【目的】南蛇藤素（Celastrol,CeT）又名雷公藤红素（Tripterine）,是从植物雷公藤中提取的一种单体,属三萜类化合物,分子式为C29H38O4,相对分子量为450。南蛇藤素具有免疫抑制及影响细胞增殖的作用[1,2],临床上多用于与免疫异常相关的疾病的治疗和某些肿瘤的辅助治疗,尚未有将其用于心血管疾病治疗的报告。本研究观察南蛇藤素在对血小板功能的影响,以及其对ApoE基因敲除小鼠在动脉粥样硬化斑块形成的早期阶段主动脉壁和动脉斑块中巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor, MIF）和基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9, MMP-9）表达的影响。探讨南蛇藤素的抗动脉粥样硬化作用及机制。【方法】静脉血采自至少两周未服用任何药物的健康志愿者,枸橼酸抗凝;离心后获得富含血小板的血浆（platelet-rich plasma, PRP）,通过CL-2B琼脂糖凝胶柱获得凝胶过滤的血小板（Gel filtered platelets, GFP）。血小板聚集实验:PRP与不同浓度的南蛇藤素于37℃孵育10min,加入终浓度为10μmol/L ADP诱导血小板聚集,采用Biodata PAP-4聚集仪测定聚集度,以观察南蛇藤素对血小板聚集功能的影响。血小板激活实验:室温下血小板与不同浓度的南蛇藤素（0.1-10μmol/L）共同孵育20min,DMSO作为对照;加入终浓度为20μmol/L的ADP,采用流式细胞仪检测血小板表面CD62P的表达和PAC-1的结合量,以观察南蛇藤素对血小板激活的影响。血小板在纤维蛋白原表面的黏附实验:直径12mm圆形玻片用30μg/ml的纤维蛋白原包被; 2.4×107/ml的GFP与不同浓度的南蛇藤素（1, 2, 5μmol/L ）室温中孵育10min,DMSO作为对照,加入终浓度为10μmol/L的ADP以激活血小板,37℃孵育30min,显微镜下观察,以检测南蛇藤素对血小板黏附功能的影响。动物实验:8周龄雄性ApoE基因敲除小鼠12只,随机分为南蛇藤素干预组和DMSO对照组,每组各6只,均给以高脂饮食（含21%脂肪和0.21%胆固醇）饲养8周,在高脂饲养的后4周,分别予以南蛇藤素2mg.kg-1。d-1和相当剂量的溶剂二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）腹腔注射。采用annexin V检测血小板表面磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）的暴露量,同时采用流式细胞仪以FITC-兔抗人纤维蛋白原多克隆抗体检测血小板的激活情况。小鼠处死后行主动脉连续石蜡切片、HE染色观察主动脉组织形态学改变,测定主动脉根部粥样斑块面积,同时采用免疫组化方法检测主动脉壁和动脉粥样硬化斑块内MIF、MMP-9的表达。【结果】南蛇藤素在体外可以抑制ADP诱导的血小板聚集:南蛇藤素在高浓度（0.05-0.5mmol/L）可以显著抑制10μmol/L ADP诱导的血小板聚集。南蛇藤素在体外可以抑制ADP诱导的血小板活化,抑制P-选择素的IC50为1.62μmol/L。抑制PAC-1的IC50为1.86μmol/L。南蛇藤素还可抑制ADP诱导的血小板黏附,5μmol/L南蛇藤素显著抑制20μmol/L ADP诱导的血小板在纤维蛋白原表面的黏附。动物实验中,南蛇藤素组血小板表面PS的暴露低于DMSO组,但两组间无统计学差异;南蛇藤素组ADP诱导的血小板激活程度显著低于对照组。对照组形成了早期斑块;南蛇藤素组斑块面积较对照组明显减小,分别为4947.63±1277.42μm 2和8403.87±2535.73μm 2 （ P <0. 01）,斑块面积/动脉壁横切面积也明显降低,分别为0.05047±0.01653和0.08224±0.02056 （P <0. 01）.南蛇藤素组与对照组比较,主动脉壁内MIF表达明显降低,平均光密度值分别为0.02182±0.00813和0.05363±0.01474 （P<0.01） , MMP-9的表达也明显降低,平均光密度值分别为0.03568±0.00777和0.01763±0.00576 （P <0. 01）;动脉斑块内MIF表达明显降低,平均光密度值分别为0.0114±0.00163和0.02270±0.00390 （ P <0. 01）,MMP-9的表达也明显降低,平均光密度值分别为0.00536±0.00202和0.02630±0.00800 （ P <0. 01）。【结论】体外及体内实验研究显示,南蛇藤素可以抑制ADP诱导的血小板激活、聚集和黏附,这也可能是南蛇藤素抗炎作用的机制之一;同时提示,南蛇藤素也可能通过对血小板功能的抑制而发挥抗血栓作用。南蛇藤素还可能通过下调MIF和MMP-9的表达,抑制炎症介质的释放,起到抑制动脉粥样硬化斑块形成和稳定斑块的作用。
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