利用ptr抗性基因提高普那霉素产量及其家族改组技术研究

论文摘要

普那霉素（pristinamycin）由始旋链霉菌（Streptomyces prhstinaespiralis）产生,包含普那霉素Ⅰ（PⅠ）和普那霉素Ⅱ（PⅡ）两类化合物,主要用于治疗由包括耐药菌在内的革兰氏阳性菌引起的感染。目前,缺乏稳定遗传的高产菌株是制约普那霉素发酵生产和临床应用的主要原因之一。为此,本文利用抗生素产生菌的抗性水平与抗生素产量之间的正相关性,通过提高始旋链霉菌的ptr抗性基因拷贝数的方法进行了普那霉素高产菌株的分子选育研究,进而验证利用抗性基因通过分子育种手段提高普那霉素产量的可行性。接着,本文还利用DNA家族改组技术对ptr抗性基因及其同源基因进行定向进化,为有效提高普那霉素产量打下基础。1.以整合型载体pSET152为出发质粒,首次建立起从大肠杆菌ET12567与始旋链霉菌ATCC25486属间接合转移体系。在对热激条件、抗生素筛选浓度、孢子浓度、接合平板以及Mg2+浓度等条件分别进行优化后,大肠杆菌和始旋链霉菌的属间接合转移效率可达1.36×10-3,且质粒pSET152在传代10次后仍然稳定存在,为始旋链霉菌的基因改造提供了有力的技术基础。2.为寻找新的普那霉素高产菌株选育方法,通过提高始旋链霉菌的ptr抗性基因拷贝数的方法,进行了高产菌株的分子选育研究。首先优化了链霉菌基因组DNA的PCR扩增体系,获得ptr抗性基因。将ptr转移到始旋链霉菌中表达获得146个转化子,经普那霉素抗性初筛、发酵复筛,最终筛选出SPR1和SPR2两个高产转化子,产量分别是0.11 g/l和0.15g/l,与原始菌株ATCC25486相比,产量增加6-8倍,且传代5次后产量稳定。3.为进一步提高普那霉素的产量,采用DNA家族改组的方法对普那霉素抗性基因进行人工进化。通过优化PCR条件,从链霉菌基因组DNA中扩增出ptr基因及其同源基因actV、mmr全长序列,通过T载体克隆到大肠杆菌获得重组工程菌。然后用DNaseI对3种等量混合的重组质粒低温消化,回收100-600bp左右的酶切产物,以这些酶切产物为模板经无引物PCR、有引物PCR获得1.8kb大小的改组分子,并构建起库容约为1.83×105的改组文库。该研究以基因的重组质粒为模板进行家族改组,对同源性较低基因的家族改组技术作出了改进。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 普那霉素及其生物合成的研究进展
• 1.1.1 普那霉素的化学结构
• 1.1.2 普那霉素的理化性质
• 1.1.3 普那霉素的抗菌活性
• 1.1.4 普那霉素合成的相关基因概述
• 1.1.5 普那霉素生物合成的基因工程进展
• 1.2 抗生素抗性基因的分子育种
• 1.2.1 抗生素的抗性基因概述
• 1.2.2 改造抗性基因提高抗生素产量
• 1.3 链霉菌接合转移体系研究进展
• 1.3.1 链霉菌接合转移的提出
• 1.3.2 链霉菌接合转移常用载体
• 1.4 DNA家族改组技术的进展与应用
• 1.4.1 DNA家族改组技术的原理和产生
• 1.4.2 DNA家族改组技术的新发展
• 1.4.3 DNA家族改组技术的新应用
• 1.4.4 展望
• 1.5 本论文的研究思路和目标
• 第二章 始旋链霉菌遗传转化方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 接合平板中筛选转化子抗生素浓度的确定
• 2.3.2 传代培养基中安普拉霉素浓度的确定
• 2.3.3 热激处理对孢子活力的影响
• 2.3.4 接合转移平板培养基的选择
• 2.3.5 孢子浓度的选择
• 2+浓度对接合转移效率的影响'>2.3.6 Mg²⁺浓度对接合转移效率的影响
• 2.3.7 PCR验证及pSET152的稳定性
• 2.4 本章小结
• 第三章 利用ptr抗性基因提高抗生素产量
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 ptr抗性基因的克隆
• 3.3.2 ptr抗性基因在大肠杆菌与始旋链霉菌间的接合转移
• 3.3.3 普那霉素对始旋链霉菌的最小抑制浓度的测定
• 3.3.4 普那霉素高产菌株的筛选
• 3.3.5 高产菌株的遗传稳定性
• 3.4 本章小结
• 第四章 ptr抗性基因家族改组库的构建
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.3 实验仪器
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.5 ptr、actV、mmr基因的克隆
• 4.2.6 DNA家族改组技术体系研究
• 4.2.7 ptr改组基因库的建立
• 4.2.8 ptr改组基因库的鉴定
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 ptr、actV、mmr基因的获取
• 4.3.2 ptr、actV、mmr基因的克隆
• 4.3.3 ptr抗性基因的DNA家族改组库的建立
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 论文创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 作者简历