靶向MRP1基因RNAi逆转肺癌A549/DDP细胞多药耐药研究

论文摘要

目的:探讨通过RNA干扰技术沉默MRP1基因对人肺癌A549/DDP细胞多药耐药的逆转效果。方法:针对MRP1 mRNA序列设计合成2对编码shRNA的DNA模板序列,定向克隆到pSicencer-2.1-U6 neo质粒载体上,构建2种表达shRNA的重组载体,经测序鉴定后电转染A549/DDP细胞,经G418筛选后制备转染细胞单克隆,经PCR扩增基因组DNA鉴定和流式细胞术检测MRP1蛋白表达水平筛选单克隆后扩大培养。通过荧光定量PCR检测MRP1 mRNA表达水平、流式细胞术、免疫荧光检测MRP1蛋白表达水平,通过MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性,通过流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期变化和在荧光显微镜下及琼脂糖凝胶电泳时,药物作用后细胞呈现的形态结构和生化特征,从而检测细胞耐药逆转效果。结果:1.用pSicencer-2.1-U6 neo质粒成功构建了2种表达shRNA的重组载体,即p2.1-1和p2.1-2;2.重组载体成功转染A549/DDP细胞,获得了稳定转染细胞单克隆;3.荧光定量PCR和流式细胞术检测结果显示,2对干涉片段（2种重组载体）均能不同程度地抑制A549/DDP细胞MRP1基因表达,MRP1 mRNA抑制率分别为52.11±0.00%、44.97±0.81%;流式细胞术结果表明多药耐药相关蛋白表达抑制率分别为59.83±1.44%,36.19±0.74%,免疫荧光结果显示多药耐药相关蛋白表达率明显下降,干涉片段1的抑制作用优于干涉片段2,使细胞周期发生改变,细胞凋亡率升高;4.Rho123外排实验结果显示,2种重组载体转染的A549/DDP细胞MRP1蛋白的外排转运功能均有不同程度降低;5.MTT检测结果显示,转染2种重组质粒的A549/DDP细胞对顺铂和五氟尿嘧啶的敏感性增强,耐药性均有不同程度逆转,单克隆A549/DDP/sh-MRP1-p2.1-1-1和A549/DDP/sh-MRP1- p2.1-2-1对顺铂的相对逆转率分别为79.35±1.86%、59.74±0.64%,对五氟尿嘧啶的相对逆转率分别为78.55±0.59%、57.93±1.80%;6.在荧光显微镜下以及琼脂糖凝胶电泳时,用顺铂和五氟尿嘧啶作用后,转染p2.1-1和p2.1-2重组质粒的A549/DDP细胞均呈现明显的凋亡特征。结论:本实验设计的2对编码shRNA的DNA干扰片段所构建的重组载体均能转染A549/DDP细胞,并能不同程度地抑制A549/DDP细胞MRP1基因的表达,不同程度地逆转A549/DDP细胞的耐药性,干扰片段sh-MRP1-p2.1-1优于干扰片段sh-MRP1- p2.1-2,转染细胞单克隆间存在逆转差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 RNA 干扰技术的研究
• 1.1.1 RNAi 的研究历史
• 1.1.2 RNAi 的功能及分子生物学机制
• 1.1.3 RNAi 的作用特征
• 1.1.4 RNAi 的设计及筛选
• 1.1.5 siRNA 的制备
• 1.1.6 RNA 干扰的生物学意义
• 1.1.7 RNAi 技术的应用
• 1.1.8 RNAi 技术的存在的问题和展望
• 1.2 肿瘤多药耐药研究进展
• 1.2.1 多药耐药研究机制
• 1.2.2 肿瘤多药耐药的逆转方法
• 1.3 本论文的主要研究目的、意义和主要内容
• 1.3.1 本论文的研究目的及意义
• 1.3.2 本论文研究的主要内容
• 2 靶向mrpl 基因shRNA 表达载体构建及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 宿主菌
• 2.1.2 质粒载体
• 2.1.3 载体通用引物
• 2.1.4 主要试剂及工具酶
• 2.1.5 电泳缓冲液及培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 shRNA DNA 模板的设计与退火
• 2.2.2 重组载体的构建
• 2.2.3 重组载体的筛选鉴定
• 2.2.4 重组质粒载体大量提取
• 2.3 实验结果及分析
• 2.3.1 质粒经HindⅢ和BamHI 双酶切
• 2.3.2 质粒酶切产物的回收
• 2.3.3 重组载体的菌落PCR
• 2.3.4 重组质粒小量提取
• 2.3.5 重组质粒的测序鉴定
• 2.3.6 重组质粒大提的OD 值检测
• 2.4 讨论
• 3 A549/DDP 细胞的电转染和筛选鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 pEGFP-N1 质粒
• 3.1.2 细胞株
• 3.1.3 主要药品及试剂配置
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 A549 和A549/DDP 细胞的培养
• 3.2.2 A549 细胞和A549/DDP 细胞生长曲线绘制
• 3.2.3 电转染A549/DDP 细胞条件的优化
• 3.2.4 重组质粒的线性化
• 3.2.5 线性化重组质粒电转染A549/DDP 细胞
• 3.2.6 G418 压力筛选阳性克隆
• 3.2.7 单克隆细胞的制备
• 3.2.8 PCR 鉴定转染细胞基因组与重组载体的整合
• 3.2.9 流式细胞术筛选转染单克隆细胞
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 A549 细胞与A549/DDP 细胞的培养
• 3.3.2 细胞的生长曲线
• 3.3.3 A549/DDP 细胞电转染条件优化
• 3.3.4 重组质粒的线性化
• 3.3.5 G418 杀伤曲线
• 3.3.6 G418 筛选阳性克隆
• 3.3.7 单克隆细胞制备
• 3.3.8 PCR 鉴定转染细胞基因组与重组载体的整合
• 3.3.9 单克隆细胞筛选
• 3.4 讨论
• 4 MRP1 基因的沉默效果检测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要分子生物学试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 引物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实时荧光定量PCR（Real Time fluorescence Q-PCR）检测mrp1 基因表达
• 4.2.2 流式细胞术检测MRP1 的表达水平
• 4.2.3 免疫荧光检测MRP1 的表达水平及定位
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 细胞转染前后形态学改变
• 4.3.2 实验细胞 MRP-1 mRNA 的变化
• 4.3.3 流式细胞术检测MRP1 蛋白表达水平
• 4.3.4 免疫荧光检测MRP1 蛋白表达及定位
• 4.4 讨论
• 5 A549/DDP 转染细胞多药耐药逆转效果检测
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要分子生物学试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 细胞生长曲线的测定
• 5.2.2 MTT 法检测细胞的药物敏感性变化
• 5.2.3 荧光显微镜观察细胞经肿瘤药物作用下的凋亡情况
• 5.2.4 DNA 片段化检测的测定
• 5.2.5 细胞周期分析
• 5.2.6 统计学方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 转染单克隆细胞的生长曲线
• 5.3.2 各组细胞对抗肿瘤药物的敏感性
• 5.3.3 荧光显微镜检测细胞经肿瘤药物作用的形态学变化
• 5.3.4 DNA 片段化检测 Ladder
• 5.3.5 流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A 实验图
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢