牛分枝杆菌和BCG诱导树突状细胞分泌细胞因子的研究

论文摘要

结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的一种慢性消耗性的人畜共患传染病。据估计,全球大约有1/3的人感染了结核,但其中只有不到10%的人发病,这主要是由于结核分枝杆菌的感染激活了机体的免疫反应,限制了细菌的感染,最终维持了一种宿主与细菌共存的平衡状态。牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病,可以引起包括人、家畜以及野生动物发病的疾病,被列为国际动物卫生组织（OIE）必须通报疫病之列。全球每年因结核病导致畜牧业产生的直接经济损失约为30亿美元。据统计,全世界约10%以上的人结核病是由牛分枝杆菌引起的。牛结核病给畜牧业的发展和人类健康带来重大影响,也同时成为世界性的公共卫生问题。卡介苗（BCG）是牛分枝杆菌在1908年到1921年间传了230代之后,丢失了很多区域得到的减毒株。卡介苗是目前唯一商业化应用的结核病疫苗,虽有不足,但它确实能够诱导较强的免疫保护反应。同时用卡介苗和牛分枝杆菌作为模式菌有利于发现结核的致病机制。并且,由于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌在基因组序列上有99.95%的同源性,与结核分枝杆菌相比,牛分枝杆菌没有任何独特的基因。因此,利用BCG和毒力型牛分枝杆菌得出的发现,也有助于对结核分枝杆菌致病机制的理解。细胞因子及趋化因子在抵抗结核感染中发挥着极其重要的免疫调节作用。细胞因子能够广泛地调控机体免疫应答和造血功能,并参与炎症损伤等病理过程。趋化因子可以刺激白细胞的趋化性,吸引中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎性细胞移动到炎症灶,并增强炎性细胞的吞噬杀伤作用,促进它们释放炎性介质,直接参与炎症过程。本研究利用牛分枝杆菌和卡介苗感染树突状细胞,感染比为10：1,之后依次收集了感染后6h,12h和24h的培养上清,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了8种细胞因子及趋化因子的含量；通过阻断树突状细胞表面受体TLR2和TLR4以及NF-κB,检测其对细胞因子及趋化因子分泌量的影响；利用荧光定量PCR和Western blot检测了TLR/NF-κB信号通路关键分子的相对表达量。最后,本研究分析了牛分枝杆菌和BCG差异性诱导树突状细胞分泌细胞因子及趋化因子的产生及其调控通路,主要结果如下：1.BCG与牛分枝杆菌诱导树突状细胞分泌细胞因子及趋化因子的差异收集感染后6h,12h和24h的细胞培养上清。用ELISA检测试剂盒检测了8种细胞因子及趋化因子的分泌量,包括IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12, IL-23, TNF-a, RANTES以及MCP-1。结果显示,在未感染的DC培养上清中,IL-4的量很低,只有31.2±0.2pg/mL。感染了BCG或M. bovis后,IL-4的量会有一个缓慢的上升,但总量仍然很低。暗示在抵抗结核感染中,体液免疫的作用不是主要的。而其它的细胞因子及趋化因子（IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23, TNF-α, RANTES和MCP-1）的量,在DCs感染BCG或M. bovis后,都有一个非常明显地升高。并且相对于M. bovis, BCG诱导了更高浓度的IL-6, IL-12, TNF-α, RANTES和MCP-1。而M. bovis则诱导了更高浓度的IL-1β和IL-23,说明M. bovis趋向于诱导炎性反应。2.荧光定量PCR检测TLR/NF-κB信号通路关键分子的相对表达量检测了5个关键的信号通路相关基因TLR2, TLR4, Myd88, NF-κB p50和p65业基在BCG与牛分枝杆菌感染的树突状细胞中的转录差异。结果显示,BCG感染组的TLR2, TLR4, Myd88, NF-κB p50和p65亚基的转录量要高于牛分枝杆菌感染组。3. Western blot检测NF-κB通路相关蛋白的表达Western blot结果显示,BCG感染组的磷酸化NF-κB p65亚基的表达量明显高于M. bovis感染组；而M. bovis感染组的NF-κB的抑制业基I-κB的量则明显高于BCG感染组。这说明BCG感染组的NF-κB活化程度明显高于M bovis感染组。在使用NF-κB的抑制剂PDTC后,BCG或M. bovis感染组的磷酸化NF-κB p65亚基的量下降了,说明PDTC抑制了NF-κB的活化。4.阻断树突状细胞表面受体TLR2、TLR4以及NF-κB后,对细胞因子及趋化因子分泌量的影响利用抗体阻断TLR2后,无论是BCG感染组还是M. bovis感染组,IL-1β,IL-6, MCP-1和RANTES的量明显被抑制了。TLR4抗体并没有此抑制效应。与此同时BCG感染组和M. bovis感染组的IL-1β, IL-6, MCP-1和RANTES的分泌可以被PDTC阻断。说明IL-1β, IL-6, MCP-1和RANTES的分泌是受TLR2/NF-κB信号通路调控的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 文献综述
• 前言
• 1.1 结核分枝杆菌与免疫
• 1.1.1 结核分枝杆菌及其宿主细胞
• 1.1.2 结核分枝杆菌与免疫逃避
• 1.1.3 结核分枝杆菌与卡介苗
• 1.2 树突状细胞在结核免疫中的作用
• 1.2.1 树突状细胞的生物学特性
• 1.2.2 树突状细胞与结核分枝杆菌的相互作用
• 1.3 TLR/NF-κB信号通路
• 1.3.1 Toll样受体
• 1.3.2 NF-κB信号通路
• 1.3.3 Toll样受体/NF-κB信号通路与细胞因子及趋化因子的分泌
• 2. 研究目的与意义
• 3. 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验所用菌株及实验动物
• 3.1.2 细菌及细胞培养基
• 3.1.3 荧光定量PCR相关引物
• 3.1.4 主要试剂
• 3.2 牛分枝杆菌与卡介苗的培养计数
• 3.3 树突状细胞的培养与鉴定
• 3.3.1 树突状细胞的培养
• 3.3.2 树突状细胞的鉴定
• 3.4 树突状细胞的细菌感染实验
• 3.5 树突状细胞感染后,细胞因子及趋化因子的检测
• 3.6 调节DCs分泌细胞因子及趋化因子的信号通路的检测
• 3.6.1 Real time PCR检测TLR/NF-κB信号通路相关基因的转录水平
• 3.6.1.1 树突状细胞总RNA的提取
• 3.6.1.2 将提取的RNA反转录为cDNA
• 3.6.1.3 荧光定量PCR检测
• 3.6.2 Western blot对NF-κB通路关键蛋白表达水平的检测
• 3.6.3 TLR/NF-κB通路的阻断实验
• 3.6.3.1 中和抗体阻断TLR2和TLR4
• 3.6.3.2 PDTC阻断NF-κB的核转位
• 4. 结果
• 4.1 树突状细胞的纯度与成熟状态的鉴定
• 4.2 感染后树突状细胞分泌细胞因子及趋化因子的情况
• 4.3 荧光定量PCR检测TLR/NF-κB信号通路相关基因的转录水平情况
• 4.4 Western Blot检测NF-κB通路蛋白
• 4.5 阻断TLR/NF-κB信号通路后,对树突状细胞分泌细胞因子及趋化因子的影响情况
• 5. 讨论
• 5.1 牛分枝杆菌诱导DCs分泌细胞因子及趋化因子的差异与结核病致病机理之间的关系
• 5.2 调节DCs分泌细胞因子及趋化因子的信号通路的初步探讨
• 6. 结论
• 参考文献
• 致谢