栽培花生基因组BAC文库的构建

论文摘要

栽培花生（Arachis hypogaea L.）是异源四倍体,含有A和B两个基因组。现有研究认为四倍体栽培种是由二倍体种A.duranensis（A genome）和A.ipaensis（B genome）单一杂交后经染色体自发加倍而成。单一杂交起源、多倍化引起的生殖隔离和少数育种亲本的使用,使栽培花生基因组高度保守,遗传多样性非常有限,因此,利用遗传作图的方法分析基因十分困难。花生基因组BAC文库的构建,对利用物理图谱的方法来分析花生基因组有很大的价值,可从该文库中调取大量有用的基因,在利用基因工程技术改良作物品种性状、开展分子育种等方面发挥重要作用。本实验以栽培花生中花8号植株叶片为材料,参照已报道的BAC文库构建方法,在此基础上进行技术改进,建立了一套适用于栽培花生品种的BAC文库构建技术体系。选取幼嫩的植物叶片,得到了浓度适宜,分子量大于1Mb的高分子量DNA琼脂糖包埋块儿,选择合适的酶切条件回收到符合分子量要求的DNA大片段,通过建立高效的连接体系,到目前为止共得到25,344个重组克隆。随机挑取80个克隆经小量碱裂解法提取质粒酶切鉴定,脉冲凝胶电泳结果显示,插入片段大小在30kb-150kb之间,平均插入片段大小为80kb,空载率为1.25%。随机挑取3个BAC克隆做稳定性继代实验,连续培养100代之后,BAC克隆依然稳定,没有重排现象。本实验构建的BAC文库是我国迄今构建的第一个栽培花生BAC文库,尽管文库覆盖率到目前为止还不能满足作图和测序的需要,但是建立了一个完整高效的适用于栽培花生基因组的BAC文库构建技术体系。

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Abstract

英文缩略表

1 文献综述

1.1 前言

1.2 大片段基因组文库的研究进展

1.2.1 λ噬菌体文库

1.2.2 柯斯（Cosmid）文库

1.2.3 YAC文库

1.2.4 BAC文库

1.2.4.1 BAC载体的发展

1.2.4.2 BAC载体的优点

1.2.5 BIBAC载体

1.3 BAC文库的构建流程

1.3.1 BAC载体的制备

1.3.2 高分子量DNA（HMW-DNA）的制备

1.3.3 高分子量DNA的部分消化

1.3.4 载体与高分子量DNA连接技术

1.3.5 重组子的电击转化技术

1.3.6 BAC文库的质量检测

1.4 BAC文库的应用

1.4.1 基因的图位克隆

1.4.2 基因组物理图谱构建及基因组测序

1.4.3 BAC-FISH

1.4.4 BAC转基因技术

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试品种

2.1.2 菌株来源

2.1.3 载体来源

2.1.4 主要药品及试剂

2.1.5 主要仪器设备和耗材

2.2 方法

2.2.1 BAC载体的获得

2.2.2 载体质量检测

2.2.2.1 大肠杆菌EP1300电转化感受态细胞的转化效率检测

2.2.2.2 载体质量检测

2.2.3 大片段核DNA的制备

2.2.3.1 材料的预处理

2.2.3.2 细胞核的提取

2.2.3.3 Plug的制备

2.2.3.4 大片段核DNA质量检测

2.2.4 限制性酶切

2.2.4.1 酶切前预处理

2.2.4.2 最适酶切条件的选择

2.2.4.3 大量酶切

2.2.5 酶切大片段的纯化回收

2.2.5.1 酶切片段的纯化

2.2.5.2 大片段的回收

2.2.6 连接与转化

2.2.6.1 预连接

2.2.6.2 脱盐

2.2.6.3 电转化

2.2.7 空载率和插入片段大小的初步检测

2.2.7.1 BAC DNA的提取

2.2.7.2 Not Ⅰ酶切

2.2.8 大量连接转化

2.2.9 BAC克隆的挑取和BAC文库的建成

2.2.10 文库质量检测

2.2.10.1 插入片段大小检测

2.2.10.2 克隆稳定性检测

3 结果与分析

3.1 EP1300商用感受态和BAC载体质量的鉴定

3.2 大片段DNA包埋胶块儿的制备

3.3 部分酶切最适酶量的确定

3.4 部分酶切及大片段回收

3.5 DNA大片段的连接与转化

3.6 插入片段大小的检测

3.7 BAC克隆稳定性的检测

3.8 文库覆盖率

4 讨论

4.1 花生基因组BAC文库构建过程中遇到的问题

4.1.1 针对花生细胞核提取的优化

4.1.2 酶切过程遇到问题的探讨

4.1.3 大片段纯化步骤的改进

4.1.4 DNA电洗脱过程中遇到的问题

4.1.5 提高连接转化效率的措施

4.2 工作不足及下一步工作计划

参考文献

致谢

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