PAMAM-抗体偶联物的制备、体外抗癌及抗粘附研究

论文摘要

目的肿瘤手术后的转移造成的死亡是全球急待解决的重大社会和科技问题。其根源是体内低活性残存的循环肿瘤细胞（CTCs）,“抗癌药”对其无效。基于高分子树枝状聚合物良好的生物相容性、可降解性、较好的尺寸效应及多价络合效应,本文选取粒径<10 nm的第六代聚酰胺-胺型树枝状高分子作为载体,以针对结肠癌肿瘤细胞表面高表达的生物标记物（EpCAM、 Sialyl Lewis X）为靶点,多价连接不止一种可敏感识别这些标记物的靶向配体（anti-EpCAM、anti-Sialyl Lewis X）,制备出高效特异性的纳米材料-单/双靶向配体偶联物,以特异性捕获结肠癌细胞。考察这些偶联物的络合稳定性,并探究其对结肠癌系列细胞株的体外抗癌活性和抗粘附影响,从而为特异性捕获CTCs并抑制其活性提供理论参考。方法本文首先采用丁二酸酐对G6 PAMAM表面进行修饰,合成完全羧化的G6PAMAM衍生物,后通过调整完全羧化的G6 PAMAM与两种靶向抗体之间的摩尔比例而制备G6 PAMAM-5aEpCAM （G6-5A）、 G6 PAMAM-5aSialyl Lewis X （G6-5S）及G6 PAMAM-5aEpCAM-5aSialyl Lewis X （G6-5A-5S）单/双靶向配体偶联物。运用1NMR、FTIR、UV-Vis及DES等手段对偶联物的结构、粒径及电荷特性等进行表征并探索其在不同温度、pH、振荡速率下的稳定性；采用MTT比色法考察所合成的偶联物对人结肠癌细胞株（LoVo、 SW480）体外增殖抑制情况；应用流式细胞仪检测分析偶联物对细胞周期分布的影响；采用MTI’法和荧光显微镜拍照法考察偶联物对人结肠癌细胞株体外抗粘附能力的影响。结果通过优化条件,可成功制备出尺寸可控、结构精确的G6-5A、G6-5S、 G6-5A-5S偶联物,且这些偶联物（pH 7.4）可在37℃下稳定存在12 h以上,4℃稳定存在两星期以上,几乎不受振荡速率的影响（即使在210 rpm下）；与完全羧化的G6 PAMAM相比,这三种偶联物均可抑制结肠癌细胞的生长并呈浓度依赖性,且使细胞被阻滞在G0/G1期；体外粘附实验表明这三种偶联物均具有抑制人结肠癌细胞粘附基质和人脐带内皮细胞的能力。结论所合成的偶联物不仅能抑制人结肠癌细胞的增值,阻滞其周期,还可以抑制结肠癌细胞对基质或脐静脉内皮细胞的粘附。所有这些前期研究可为后期预防癌症转移的离体和在体研究提供重要的理论依据和参考。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 前言
• 1.1 术后肿瘤转移的研究现状
• 1.1.1 肿瘤转移的危害
• 1.1.2 循环肿瘤细胞简介
• 1.1.3 预防术后肿瘤转移的治疗现状
• 1.1.4 生物纳米材料在肿瘤治疗方面的研究进展
• 1.2 树枝状大分子的研究进展
• 1.2.1 树枝状大分子的发展简介
• 1.2.2 树枝状大分子的结构及分类
• 1.2.3 树枝状大分子的应用现状
• 1.2.4 聚酰胺-胺树状大分子简介
• 1.3 聚酰胺-胺树枝状大分子的理化特性
• 1.3.1 聚酰胺-胺树枝状大分子的构象变化
• 1.3.2 聚酰胺-胺树枝状大分子的多位点作用
• 1.3.3 聚酰胺-胺树枝状大分子的生物相容性
• 1.4 聚酰胺-胺树状聚合物现有的功能化修饰方法
• 1.4.1 提高生物相容性的修饰手段
• 1.4.2 标记物修饰聚酰胺-胺树枝状大分子
• 1.4.3 靶向配体修饰聚酰胺-胺树枝状大分子
• 1.5 聚酰胺-胺树状聚合物在癌症靶向治疗中的载体作用
• 1.5.1 物理包封
• 1.5.2 化学偶联
• 1.6 本论文的主要研究内容及创新点
• 1.6.1 论文主要研究内容
• 1.6.2 论文创新点
• 第二章 聚酰胺-胺树状分子-靶向配体偶联物的合成与表征
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.1.1 主要的实验药品与试剂
• 2.1.2 主要的仪器设备与耗材
• 2.1.3 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 G6 PAMAM的结构修饰
• 2.2.2 G6 PAMAM纳米材料-单/双靶向配体偶联物的合成
• 2.2.3 G6 PAMAM衍生物的结构表征
• 2.3 实验结果及讨论
• 2.3.1 产品核磁共振分析
• 2.3.2 产品的红外光谱分析
• 2.3.3 UV-Vis结果分析
• 2.3.4 粒径及表面电势测试
• 2.4 小结
• 第三章 聚酰胺-胺树状分子-靶向配体偶联物稳定性研究
• 3.1 实验材料和仪器
• 3.1.1 主要的实验药品与试剂
• 3.1.2 主要的仪器设备与耗材
• 3.1.3 常用溶液的配制
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果及讨论
• 3.4 小结
• 第四章 聚酰胺-胺树状分子-靶向配体偶联物对结肠癌系列细胞株的体外抗癌活性研究
• 4.1 实验材料和仪器
• 4.1.1 主要的实验药品与试剂
• 4.1.2 主要的仪器设备与耗材
• 4.1.3 常用溶液的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 MTT法测试细胞毒性
• 4.2.3 流式细胞技术检测细胞周期分布
• 4.2.4 统计学处理
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 单/双抗偶联物对同一种细胞的活性调控结果
• 4.3.2 单一偶联物对不同结肠癌细胞的活性调控结果
• 4.3.3 PI单染检测单/双抗偶联物对结肠癌系列细胞株周期分布结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 聚酰胺-胺树状分子-靶向配体偶联物对结肠癌系列细胞株的体外抗粘附研究
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.1.1 主要的实验药品与试剂
• 5.1.2 主要的仪器设备与耗材
• 5.1.3 常用溶液的配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 细胞培养
• 5.2.2 MTT法检测偶联物对结肠癌细胞株与基质成分Fn粘附的影响
• 5.2.3 荧光显微镜拍照法考察偶联物对结肠癌细胞株与HUVECs粘附的影响
• 5.2.4 统计学处理
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 单/双抗偶联物对结肠癌细胞株与Fn粘附的影响结果
• 5.3.2 单/双抗偶联物对结肠癌细胞株与HUVECs粘附的影响结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录—核磁图谱
• 个人简历