论文摘要
Notch信号途径在哺乳动物细胞增殖、分化和凋亡等命运决定中起关键作用。其异常调控可引起组织发育异常并导致肿瘤等多种疾病的发生。研究表明,Notch信号途径的受体之一Notch1在许多肿瘤中存在异常表达,根据肿瘤的组织来源和细胞类型,Notch1可起促癌或抑癌作用。目前,Notch1已成为潜在的肿瘤治疗靶点。舌鳞癌是最常见的口腔癌,Notch1在舌鳞癌中的表达和作用至今仍未明确。近年来的研究表明,Notch1与表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor,EGFR）信号途径在许多肿瘤的发生、发展中存在交互作用。根据肿瘤的组织来源和细胞类型,两者可相互协同或相互拮抗。EGFR在舌鳞癌等多种肿瘤中过表达,导致相关信号途径异常活化,促进肿瘤生长、抑制细胞凋亡、导致放化疗敏感性下降、引起复发及预后不良。抑制EGFR表达和（或）阻断其相关信号途径可抑制舌鳞癌等肿瘤的生长。目前,EGFR已成为极具发展潜力的肿瘤治疗靶点,通过单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂等药物靶向治疗头颈部鳞癌等肿瘤的研究已取得较大进展,但仍存在着药物敏感性不高、肿瘤细胞耐药以及药物不良反应等问题。研究EGFR与其他信号途径的交互作用,可能为肿瘤的多靶点分子靶向治疗开辟新的途径。Notch1与EGFR信号途径在舌鳞癌中的交互作用至今仍未明确。本研究探讨了Notch1在人舌鳞癌中的表达和作用及其与EGFR信号途径的交互作用,为揭示口腔癌的分子病理机制及口腔癌的多靶点分子靶向治疗研究提供实验基础。第一部分Notch1和EGFR在人正常舌黏膜、舌黏膜癌前病变和舌鳞癌中的表达目的研究Notch1和EGFR在人正常舌黏膜、舌黏膜癌前病变和舌鳞癌中的表达。方法免疫组织化学方法检测15例人正常舌黏膜、59例舌黏膜白斑和65例舌鳞癌标本中Notch1和EGFR的表达。结果（1）在正常舌黏膜和舌黏膜白斑标本中,Notch1的阳性表达主要位于角化层,部分颗粒层和棘层细胞也有表达,基底层细胞无表达;随上皮异常增生程度的加重,Notch1的阳性细胞率和表达水平逐渐降低（P<0.05）。EGFR的阳性表达主要位于基底层,少见于棘层,颗粒层及角化层无表达;随上皮异常增生程度的加重,EGFR的阳性细胞率和表达水平逐渐增高（P<0.05）。（2）在舌鳞癌中,Notch1的阳性表达仅见于高分化和中分化标本癌巢中鳞状化生的角化细胞及类棘层细胞,癌巢周边细胞无表达;低分化标本中无Notch1表达;分化程度越高,Notch1的阳性细胞率和表达水平越高（P<0.05）;TNM分期越高,Notch1的阳性细胞率和表达水平越低（P<0.05）。EGFR的阳性表达主要位于癌巢周边细胞,处于鳞状化生的角化细胞及类棘层细胞则无表达;分化程度越高,EGFR的阳性细胞率和表达水平越低（P<0.05）;TNM分期越高,EGFR的阳性细胞率和表达水平越高（P<0.05）。结论（1）在舌黏膜上皮中Notch1的表达诱导细胞分化。随上皮异常增生程度的加重Notch1的表达逐渐下调。（2）在舌鳞癌的发生、发展中Notch1表达下调,可能起抑癌作用;而鳞状化生部位Notch1的表达可能与诱导癌细胞的分化有关。（3）根据Notch1和EGFR的表达特点,提示两者在舌鳞癌的发生、发展中可能存在交互作用。第二部分Notch1组成性活化对人舌鳞癌细胞体外生长及EGFR信号的影响目的研究Notch1组成性活化对人舌鳞癌细胞体外生长及EGFR信号的影响。方法用脂质体LipofectamineTM 2000分别将编码Notch1胞内域的真核表达质粒pRAMIC-IRES2-EGFP和对照质粒pIRES2-EGFP体外瞬时转染人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞,用RT-PCR检测Notch1和EGFR的mRNA表达变化,用Western Blot检测Notch1及其效应子Hes1、EGFR及其下游信号分子p-ERK、以及p53蛋白的表达变化,用MTT法和流式细胞术分别检测细胞增殖活性和凋亡情况,用免疫细胞化学检测Tca8113细胞Notch1和EGFR蛋白的表达变化。结果转染48h后,目的质粒转染组与未转染组相比,Notch1的mRNA和蛋白分别上调3.2倍和6.1倍,其效应子Hes1蛋白上调6.9倍,EGFR的mRNA和蛋白则分别下调12.7倍和9.3倍,其下游信号分子p-ERK蛋白下调16.6倍,而p53蛋白则上调9.7倍（均以β-actin作为内参）。目的质粒转染组与对照质粒转染组和未转染组相比,Notch1的mRNA和蛋白及Hes1蛋白显著上调（P<0.05）,而EGFR的mRNA和蛋白及p-ERK蛋白显著下调（P<0.05）,p53蛋白则显著上调（P<0.05）。目的质粒瞬时转染后,MTT法检测显示Tca8113细胞的增殖受到明显抑制（P<0.05）。转染48h后,流式细胞术检测显示细胞早期凋亡率显著增高（P<0.05）,免疫细胞化学检测显示Tca8113细胞Notch1蛋白的表达上调而EGFR蛋白的表达下调。结论（1） Notch1组成性活化抑制人舌鳞癌细胞体外增殖、诱导细胞凋亡。结合第一部分实验,提示Notch1在舌鳞癌中起抑癌作用,可能成为潜在的治疗靶点。（2） Notch1组成性活化在上调人舌鳞癌细胞Notch1及其效应子Hes1的同时,下调EGFR及其下游信号分子p-ERK蛋白,并上调p53蛋白。结合第一部分实验,提示人舌鳞癌中存在Notchl对EGFR信号的负向调控。第三部分EGFR基因沉默及阻断EGFR信号途径对人舌鳞癌细胞体外生长及Notch1信号的影响目的研究EGFR基因沉默及阻断EGFR信号途径对人舌鳞癌细胞体外生长及Notch1信号的影响。方法（1）实验一:构建靶向人EGFR基因的短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达质粒shEGFR,用脂质体LipofectamineTM 2000分别将shEGFR和作为对照的非相关序列shRNA表达质粒shNC体外瞬时转染人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞;（2）实验二:用5μM和10μM浓度的受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478分别阻断Tca8113细胞的EGFR信号途径;（3）对实验一、二,用RT-PCR检测EGFR和Notch1 mRNA的表达变化,用Western Blot检测EGFR及其下游信号分子p-ERK、Notch1及其效应子Hes1、以及p53蛋白的表达变化,用免疫细胞化学检测Tca8113细胞Notch1和EGFR蛋白的表达变化;（4）对实验一,用MTT法和流式细胞术分别检测细胞增殖活性和凋亡情况,结果（1）转染48h后,shEGFR转染组与未转染组相比,EGFR的mRNA和蛋白分别下调13.4倍和10.0倍,其下游信号分子p-ERK蛋白下调10.6倍,而Notch1的mRNA和蛋白则分别上调2.2倍和7.0倍,其效应子Hes1蛋白上调13.9倍,p53蛋白上调12.5倍。shEGFR组与shNC组和未转染组相比,EGFR的mRNA和蛋白及p-ERK蛋白显著下调（P<0.05）,而Notch1的mRNA和蛋白及Hes1蛋白显著上调（P<0.05）,p53蛋白显著上调（P<0.05）。瞬时转染shEGFR后,MTT法检测显示Tca8113细胞的增殖受到明显抑制（P<0.05）;转染48h后,流式细胞术检测显示细胞早期凋亡率显著增高（P<0.05）,细胞免疫化学显示Tca8113细胞的EGFR蛋白表达下调而Notch1蛋白表达上调。（2）在5μM和10μM的AG1478处理后,与未处理组相比,Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达均无明显改变（P>0.05）,p-ERK蛋白分别下调2.0倍和3.5倍（P<0.05）,Notch1 mRNA则分别上调1.8倍和2.7倍（P<0.05）,Notch1蛋白分别上调1.3倍和2.9倍（P<0.05）,Hes1蛋白分别上调4.4倍和14.8倍（P<0.05）,p53蛋白分别上调1.8倍和13.2倍（P<0.05）（均以β-actin作为内参）,免疫细胞化学检测显示Tca8113细胞的EGFR表达无明显变化而Notch1蛋白表达上调。结论（1）短发卡RNA介导的EGFR基因沉默下调人舌鳞癌细胞EGFR及其下游信号分子p-ERK的表达,上调p53蛋白的表达,抑制细胞体外增殖,诱导细胞凋亡。（2）受体酪氨酸激酶抑制剂阻断人舌鳞癌细胞EGFR信号途径,对EGFR的表达无明显影响,但下调其下游信号分子p-ERK蛋白的表达,而上调p53蛋白的表达。（3） EGFR基因沉默及阻断EGFR信号途径,均上调Notch1及其效应子Hes1蛋白的表达,提示人舌鳞癌中存在EGFR对Notch1信号的负向调控。（4）结合第一、第二部分实验,提示人舌鳞癌中可能存在Notch1与EGFR信号之间双向调控、相互拮抗的交互作用。
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