水稻抗逆境相关基因的分离和功能分析

论文摘要

水稻是我国和全世界重要的粮食作物,也是一个重要的功能基因研究的模式植物。各种非生物逆境（干旱、冷害和高盐等）对植物尤其是作物的生长和发育有着非常重要的影响,非生物逆境对作物的影响在许多地区已成为农业发展的瓶颈。因此进行水稻抗逆性研究,对提高作物对干旱、高盐和低温等逆境的耐受能力具有重要意义。本研究通过将一批抗逆相关基因在水稻中花11（Oryza sativa L.sspjaponica）中进行超量表达,在干旱、高盐、低温以及脱落酸（ABA）等条件下对这些转基因水稻进行抗逆性筛选,从而鉴定出一些提高水稻抗逆性的基因,得到一些抗逆性显著提高的转基因材料,用于水稻的抗逆性遗传改良。主要结果如下:1、根据水稻逆境芯片分离23个干旱诱导基因,构建了超量表达载体,通过农杆菌介导转化水稻。对这些超量表达植株进行了苗期和成株期的干旱胁迫筛选,获得了1个干旱耐性提高较为明显的转基因家系,并对该基因（OsbZIP23）进行了进一步的功能验证。2、OsbZIP23是一个具有较强转录活性的转录因子（属bZIP家族）。该转录因子定位在细胞核内,分析该基因的表达模式发现,OsbZIP23的表达受到干旱、高盐、ABA和聚乙二醇（PEG）的强烈诱导,不受低温,茉莉酸（JA）,水杨酸（SA）和2,4-D的诱导。而且相对于其它组织,OsbZIP23在水稻的叶片中有很强的表达（＞15倍）。3、OsbZIP23的超量表达植株表现出对ABA的极度敏感和对干旱、高盐的较强耐性。无论在发芽实验还是在发芽后的生长实验,OsbZIP23的超量表达家系都能被较低浓度（1-3μM）的ABA所抑制。OsbZIP23的超量表达提高了水稻对高盐的耐受能力,四叶期的幼苗在浇灌200 mM的盐水10天后,对照的叶片有65%枯黄,而OsbZIP23超量表达植株还能保持约80%的绿叶。成株期的干旱胁迫发现OsbZIP23超量表达显著提高了水稻的抗旱能力。当野生型对照都已经枯萎,而OsbZIP23超量表达植株还能保持较好的生长。考种结果显示正常条件下,野生型的结实率为90.38%,转基因家系的结实率约为70%,这主要是由于转基因过程本身引起产量下降。在配有大棚的PVC管中干旱胁迫后,野生型对照的结实率降为36%左右,而转基因超量表达家系的结实率还保持在60%以上,差异极显著。4、从本室的突变体库（RMD）中得到OsbZIP23的T-DNA插入突变体04Z11IJ69（osbzip23）,对osbzip23进行了ABA敏感性和干旱、高盐耐性的筛选。实验结果显示无论在发芽实验还是在发芽后的生长实验中,osbzip23都表现出对较高浓度ABA（5-8μM）的不敏感,由于OsbZIP23的敲除,植株的耐盐性明显下降。5、应用芯片杂交,我们对OsbZIP23的超量表达植株和突变体植株全基因组基因的表达进行了分析,结果显示有大量的抗逆相关基因在超量表达植株中上升表达,而这些基因在osbzip23中没有明显的表达变化或者下降表达。这些基因包括许多编码功能蛋白,例如脱水蛋白、LEA蛋白、脂质转运蛋白等,也包括很多的调节基因,例如AP2类转录因子、锌指类转录因子等。6、通过生物信息学,从水稻基因组中分离了30个CIPK家族基因。用Northern和RT-PCR研究了这些基因在各种胁迫条件下（干旱、高盐、低温、ABA和PEG）的表达谱,结果显示有20个基因至少受到其中一种胁迫的诱导。7、将三个分别受干旱（OsCIPK12）、高盐（OsCIPK15）、低温（OsCIPK03）诱导较强的基因进行超量表达转化并对转基因后代进行了初步的功能分析,结果显示这三个基因超量表达能提高水稻对干旱、高盐和低温的耐受能力。8、OsCIPK15在水稻根部特异性表达,其启动子受盐诱导表达。生理分析发现OsCIPK15超量表达没有改变植物体内Na+、K+的分布和含量;OsCIPK12和OsCIPK03的超量表达植株保持了较高的游离脯氨酸和可溶性糖含量。在OsCIPK12和OsCIPK03的超量表达植株中,脯氨酸合成和转运基因的表达量上升,而脯氨酸降解基因的表达有所下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写名词表
• 1 文献综述
• 1.1 植物的抗逆性
• 1.2 植物在各种非生物逆境胁迫下的应答、调节途径
• 1.2.1 植物体内非生物逆境胁迫信号传递的一般途径
• 1.2.2 非生物逆境胁迫信号在植物体内传递的信号分子
• 1.2.2.1 钙离子在植物非生物逆境信号传递中的作用
• 1.2.2.2 ABA在植物非生物逆境信号传递中的作用
• 1.2.2.3 磷脂是逆境胁迫响应过程中的另一重要信号
• 1.2.3 非生物逆境胁迫信号在植物体内传递的几个分支
• 1.2.3.1 MAPK pathways
• 1.2.3.2 CDPK pathways
• 1.2.3.3 CIPK-CBL（SOS）pathways
• 1.2.4 信号传递和胁迫应答的转录调节以及转录后调节
• 1.2.4.1 传递信号和调控基因表达的转录因子
• 1.2.4.2 感应和转导胁迫信号的蛋白激酶和其它蛋白酶类
• 1.3 提高植物抗逆性的下游功能基因及编码产物
• 1.3.1 渗透调节物质合成酶基因及产物
• 1.3.2 清除活性氧的酶基因及产物
• 1.3.3 保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白基因及产物
• 1.4 研究植物基因功能的策略和方法
• 1.4.1 基因功能增加或获得
• 1.4.2 基因功能丧失或减弱
• 1.4.3 功能基因研究的其他方法
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 水稻材料
• 2.2 用于遗传转化的水稻基因片段
• 2.3 实验所用到的菌株、质粒、载体和感受态细胞
• 2.4 DNA的抽提和Southern杂交
• 2.5 RNA的抽提,反转录和Northern杂交
• 2.6 PCR、RT-PCR和Real-time PCR的检测
• 2.7 水稻内源基因表达量分析的材料准备
• 2.8 遗传转化载体的构建和转化
• 2.8.1 超量表达载体的构建
• 2.8.2 RNAi抑制表达载体的构建
• 2.8.3 GFP及GUS融合表达载体的构建
• 2.8.4 遗传转化
• 2.9 目标蛋白的亚细胞定位分析
• 2.10 酵母细胞中的生化实验
• 2.11 GUS组织化学分析和GUS活性测定
• 2.12 成株期转基因植株在大田和PVC管的抗旱实验
• 2.13 OsbZIP23超量表达转基因植株叶片电镜观察
• 2.14 OsbZIP23超量表达转基因植株离体条件下失水速率统计
• 2.15 转基因植株的ABA敏感性实验
• 2.16 转基因植株苗期抗逆性实验
• 2.16.1 转基因植株苗期抗旱性分析
• 2.16.2 转基因植株苗期耐盐性分析
• 2.16.3 转基因植株苗期耐冷性实验
• 2.17 转基因植株的基因表达谱分析
• 2.18 游离脯氨酸含量的测定
• 2.19 可溶性糖含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 抗逆相关基因的遗传转化和抗逆筛选
• 3.1.1 转化载体的构建及遗传转化
• 3.1.2 对转基因植株进行超量表达检测
• 0代转基因植株Southern拷贝数分析'>3.1.3 部分T₀代转基因植株Southern拷贝数分析
• 3.1.4 转基因植株田间抗逆性筛选与鉴定
• 3.1.4.1 转基因植株苗期抗旱筛选与鉴定
• 1代转基因植株成株期抗旱筛选'>3.1.4.2 T₁代转基因植株成株期抗旱筛选
• 3.2 OsbZIP23基因在水稻非生物逆境中的功能研究
• 3.2.1 OsbZIP23基因的扩增和序列分析
• 3.2.2 OsbZIP23的表达模式分析
• 3.2.2.1 OsbZIP23在非生物逆境及激素处理后的表达量分析
• 3.2.2.2 OsbZIP23在不同组织的表达模式
• 3.2.3 OsbZIP23亚细胞定位和酵母细胞的生化功能分析
• 3.2.4 OsbZIP23蛋白在酵母细胞转录活性分析
• 3.2.5 OsbZIP23超量表达转基因植株抗逆性分析
• 3.2.5.1 OsbZIP23转基因植株苗期抗盐性分析
• 3.2.5.2 OsbZIP23转基因家系苗期失水速率分析
• 3.2.5.3 成株期OsbZIP23转基因植株抗旱性分析
• 3.2.5.4 OsbZIP23转基因植株ABA敏感性分析
• 3.2.6 OsbZIP23突变体的分离及表型鉴定
• 3.2.7 OsbZIP23突变体植株抗逆性分析
• 3.2.7.1 OsbZIP23突变体植株苗期抗盐性分析
• 3.2.7.2 OsbZIP23突变体植株发芽ABA敏感性分析
• 3.2.7.3 OsbZIP23突变体植株生长的ABA敏感性分析
• 3.2.8 OsbZIP23转基因植株的基因表达谱分析
• 3.3 水稻CIPK蛋白激酶家族的分离及功能鉴定
• 3.3.1 水稻中CIPK蛋白激酶家族基因的分离及结构分析
• 3.3.2 CIPK蛋白激酶家族逆境表达谱分析
• 3.3.3 OsCIPK15功能分析
• 3.3.3.1 OsCIPK15的启动子分析
• 3.3.3.2 OsCIPK15的超量表达植株的耐盐性分析
• +、K⁺吸收的分析'>3.3.3.3 OsCIPK15超量表达植株对Na⁺、K⁺吸收的分析
• 3.3.4 OsCIPK03和OsCIPK12的功能分析
• 3.3.4.1 OsCIPK03超量表达植株耐低温能力分析
• 3.3.4.2 OsCIPK12超量表达植株耐干旱能力分析
• 3.3.4.3 超量表达植株体内可溶性糖和游离脯氨酸的含量分析
• 3.3.5 水稻中CIPK与CBL基因家族突变体的收集
• 4.讨论
• 4.1 CIPK蛋白激酶在水稻抗逆性提高作用机理探讨
• 4.2 OsbZIP23在水稻逆境应答调控中的作用
• 4.3 转基因策略在提高植物抗逆性方面的应用
• 参考文献
• 附录A Protocols
• 附录B 个人简历
• 致谢