论文摘要
目的Wnt5a蛋白是一种分泌型的糖蛋白,属于Wnt家族。Wnt5a在不同类型的肿瘤中发挥着不同的作用,它能促进乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤生长甚至可促使肿瘤的侵袭。而在甲状腺癌、结肠直肠癌等肿瘤中Wnt5a可能发挥着抑制肿瘤的作用。Wnt5a在血液肿瘤中所起的作用,至今不明确。本研究通过逆转录病毒建立稳定过表达Wnt5a的K562细胞株——K562-Wnt5a细胞,观察该细胞株增殖和分化的改变,并检测稳定过表达Wnt5a对一些血液肿瘤相关基因表达的影响。方法1.以质粒pAdTrack-Wnt5a为模板,使用含有酶切位点的引物进行PCR扩增,回收PCR产物,对pSEB-flag和PCR回收产物进行酶切、纯化、连接,并转化和筛选抗性细菌克隆,提取质粒,进行酶切、测序鉴定,获得pSEB-Wnt5a。2.将质粒pCL-Ampho、pSEB-Wnt5a（或pSEB-flag）共转染HEK293细胞,并收集含有逆转录病毒的上清液。3.使用以上所得上清液感染K562细胞,并使用灭瘟素筛选抗性细胞克隆。4.RT-PCR检测K562细胞Wnt5a mRNA的表达,Western blotting检测K562细胞Wnt5a蛋白表达。病毒空载体感染K562细胞,获得K562-vector细胞; Wnt5a逆转录病毒感染K562细胞获得K562-Wnt5a细胞。5.台盼蓝活细胞染色计数法,检测细胞增殖;MTT试验检测细胞活性的变化。6.流式细胞技术检测过表达Wnt5a对K562细胞周期分布的影响。7.光镜（瑞氏染色）和透射电镜分别观察K562-Wnt5a细胞形态和超微结构变化。8.RT-PCR法检测K562-Wnt5a细胞中白血病相关基因bcr/abl、P53、Rb、WT-1和n-Ras的表达变化。结果1.扩增获得Wnt5a序列,经过酶切、连接得到重组质粒pSEB-Wnt5a,经过酶切和测序鉴定与预期目的一致。2.使用重组质粒pSEB-Wnt5a包装得到病毒,并感染K562细胞,经过筛选得到感染成功的细胞克隆,并且Wnt5a mRNA和蛋白的表达水平均升高。3.与K562-vector相比,K562-Wnt5a细胞增殖受到抑制。4.过表达Wnt5a使G2期K562细胞所占比例下降,而S期和G1期有增长的趋势。5.与K562-vector细胞相比,K562-Wnt5a细胞表现出分化的特征,如:大小不一,边缘伪足减少,核浆比变小,胞浆染色变浅,出现非特异性颗粒,细胞核聚集向细胞的一侧。电镜下,K562-Wnt5a细胞,形态变化显著,细胞核偏向一侧,常染色质较多,细胞质内细胞器发达。6.与对照细胞K562-vector细胞相比,K562-Wnt5a细胞中bcr/abl、P53、Rb、WT-1和n-Ras基因mRNA表达水平均增高。结论1.应用PCR的方法从质粒AdTrack-Wnt5a中得到Wnt5a基因序列片断,并重组得到逆转录病毒质粒pSEB-Wnt5a。2.转染HEK293细胞,包装得到含有逆转录病毒的上清,并经过感染和筛选得到稳定过表达Wnt5a的细胞株K562-Wnt5a细胞。3.稳定过表达Wnt5a改变了K562细胞的周期的分布,抑制了K562细胞的增殖,并诱导K562细胞向成熟阶段分化,这可能与它上调了一些白血病相关基因如:P53、Rb和n-Ras等基因表达有关,进一步表明Wnt5a在K562细胞中具有抑癌因子的作用;而Wnt5a与基因WT-1、融合基因bcr/abl的关系还需要进一步研究。
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