荔枝果皮组织中主要多酚氧化酶底物的研究

论文摘要

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原产我国南方,是具有较高经济价值的亚热带水果。荔枝果实采后果皮极易褐变,这极大地限制了其长期贮运,并降低其商品价值。一般认为荔枝采后褐变主要是由于果皮细胞中多酚氧化酶（PPO）与酚类底物区域化分布的破坏而导致酶促反应的发生,表现为酚类物质被催化氧化为醌,后者则通过聚合反应形成褐色产物。本研究首次对荔枝果皮组织中PPO催化的褐变底物进行了分离;鉴定了主要底物的种类、组成和化学结构;同时分析比较了内、外源底物与荔枝果皮PPO的酶学反应特性,果实发育和常温贮藏期间褐变底物含量的变化以及贮运条件对褐变底物理化性质的影响。结果表明:对荔枝果皮提取物采用聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备薄层层析（PTLC）分离纯化,0.5% FeCl3和荔枝的PPO检测,得到2个荔枝褐变底物。通过紫外（UV）、电喷雾质谱（ESI-MS）、核磁共振（NMR）等光谱分析,荔枝果皮主要的PPO褐变底物鉴定为（-）-表儿茶素和原花色素A2。比较内源底物（-）-表儿茶素和外源底物邻苯二酚与荔枝果皮PPO的酶学反应特性发现当底物不同时,PPO活性的最适pH值和最适温度不同,抑制剂和金属离子对内、外源底物与PPO酶促反应的影响也不同,此外,两个反应系统的酶促动力学参数也有差别。通过高效液相色谱（HPLC）定量分析,发现果实发育初期褐变底物积累较多,随着发育过程其含量递减;采后随着常温贮藏时间的延长,荔枝果皮褐变指数逐渐增加,果皮中褐变底物的含量逐渐降低,果皮褐变程度不断加深。此外,研究采后贮运条件对荔枝PPO底物性质的影响发现,褐变底物在光照、高温、碱性条件下结构不稳定,容易变褐;O2加速底物的酶促褐变,而CO2起减缓作用;氧化剂H2O2加速了（-）-表儿茶素的酶促褐变反应,还原剂Vc和Na2S2O5则抑制底物被PPO催化氧化。K+、Na+和Zn2+对褐变底物的稳定性无显著影响,Fe3+、Fe2+、Cu2+和Pb2+的存在影响褐变底物稳定性,而Ca2+的存在使原花色素A2不稳定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 前言
• 第一章 荔枝果实PPO底物的研究进展
• 1 荔枝果实采后多酚氧化酶酶促褐变机理
• 2 酚类褐变底物的鉴定
• 3 外界条件对酚类底物的影响
• 第二章 荔枝果皮中PPO底物的提取和纯化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 PPO 的部分纯化、酶活性及蛋白含量的测定
• 1.4 PPO 底物的提取、分离和筛选
• 1.4.1 底物的提取
• 1.4.2 底物的分离和筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 PPO 底物的分离和筛选结果
• 2.2 底物1 和底物2 与荔枝PPO 的反应
• 3 讨论
• 第三章 荔枝果皮中PPO底物的结构鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器与方法
• 1.2.1 底物紫外光谱分析
• 20)测定'>1.2.2 底物比旋光度([α]D²⁰)测定
• 1.2.3 底物ESI-MS 分析
• 1H 和¹³C NMR 分析'>1.2.4 底物¹H 和¹³C NMR 分析
• 2 结果与分析
• 2.1 紫外光谱分析
• 2.2 结构鉴定
• 2.2.1 底物1
• 2.2.2 底物2
• 3 讨论
• 第四章 荔枝果皮PPO与底物的酶学反应特性
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 PPO 的部分纯化、酶活性及蛋白含量的测定
• 1.4 PPO 与底物的酶学反应特性
• 1.4.1 pH 的影响
• 1.4.2 温度的影响
• 1.4.3 抑制剂的影响
• 1.4.4 金属离子的影响
• 1.4.5 酶促动力学参数的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 pH 值的影响
• 2.2 温度的影响
• 2.3 抑制剂的影响
• 2.4 金属离子的影响
• 2.5 酶促动力学参数
• 3 讨论
• 第五章 荔枝果实发育期间果皮中PPO底物含量的变化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 PPO 活性的测定
• 1.4 POD 活性的测定
• 1.5 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定
• 1.6 PPO 底物含量的测定
• 1.6.1 分析条件
• 1.6.2 标准曲线的绘制
• 1.6.3 PPO 底物含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 标准曲线及线性范围
• 2.2 果实在发育期间果皮中褐变底物含量及其相关酶活性的变化
• 3 讨论
• 第六章 常温贮藏期间荔枝果皮中PPO底物含量的变化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 果实褐变指数的测定
• 1.4 PPO 底物含量的测定
• 1.4.1 分析条件
• 1.4.2 标准曲线的绘制
• 1.4.3 PPO 底物含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 标准曲线及线性范围
• 2.2 荔枝果皮PPO 底物含量的变化
• 3 讨论
• 第七章 荔枝的果皮PPO底物的特性
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 光照对底物性质的影响
• 1.2.2 温度对底物性质的影响
• 1.2.3 pH 值对底物性质的影响
• 1.2.4 气体成分对底物性质的影响
• 1.2.5 氧化还原物质对底物性质的影响
• 1.2.6 金属离子对底物性质的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 光照的影响
• 2.2 温度的影响
• 2.3 pH 值的影响
• 2.4 气体成分的影响
• 2.5 氧化还原物质的影响
• 2.6 金属离子的影响
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 已发表和待发表的论文
• 致谢