重楼治疗慢性肾小球疾病的实验研究

论文摘要

第一部分中药重楼对膜性肾病大鼠的肾脏保护作用及其机制目的：探讨中药重楼对膜性肾病大鼠的肾脏保护作用及其作用机制。方法：选用雄性大鼠37只，随机选5只作为正常对照组（正常组），其余32只予以尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）复制大鼠原位免疫复合物性肾炎模型，其病理表现为膜性肾病（MN）。4周后将26只复制模型成功且存活的大鼠随机分为MN大鼠模型对照组（模型组），重楼治疗组（重楼组），雷公藤多甙治疗组（雷公藤多甙组，阳性对照组）。两治疗组分别以相应药物灌胃4周，正常组及模型组给予等量蒸馏水灌胃。分别于实验前、及实验第3、4、8周后检测大鼠24小时尿蛋白定量；实验第8周处死大鼠，检测大鼠血清白蛋白（ALB）、血清肾功能、血脂；检测大鼠肾脏组织光镜和电镜病理改变；应用间接免疫荧光法检测各组大鼠肾组织内免疫球蛋白G（IgG）、补体3（C3）的表达水平；应用免疫组织化学的方法测定各组大鼠肾组织标本Ⅳ型胶原（ColⅣ）表达和核转录因子kappaB p65（NF-κB p65）的活化；应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组大鼠肾组织标本纤维连接蛋白（FN）mRNA表达水平。结果：①实验第3周造模各组出现大量尿蛋白，于第4周尿蛋白继续升高，与正常组比较有显著性差异（P＜0.01）；两治疗组8周末的24小时尿蛋白定量与4周末比较显著降低（P＜0.05），两治疗组间无明显差异。②各组血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）比较无明显差异；模型组与正常组比较，血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）均明显升高，血清ALB明显降低（P＜0.05）；两治疗组的血清TG分别与正常对照组、模型组比较均无明显差异，血TC均明显低于模型组，血清ALB均明显高于模型组（P＜0.05），两治疗组间上述指标比较无明显差异。③间接免疫荧光显示两治疗组IgG、C3的沉积均较模型组显著减弱（P＜0.01 orP＜0.05），两治疗组间无明显差异。④光镜下观察模型组肾小球明显肿胀，球内细胞增多，肾小球基底膜增厚及节段性钉突形成，上皮下嗜复红物质沉积；两治疗组肾小球基底膜增厚不明显，上皮下沉积物均较少。半定量分析示模型组的肾小球球内细胞数、肾小球直径、截面积均明显大于正常组（P＜0.05）；重楼组与雷公藤多甙组以上各指标均显著小于模型组（P＜0.05）；两治疗组间上述指标问的差异无统计学意义。⑤电镜结果显示模型组肾小球基底膜不规则增厚，有大块电子致密物沉积于上皮下，足细胞空泡变性，足突广泛融合；两治疗组基底膜增厚不明显，足突部分融合。⑥免疫组织化学结果显示正常组肾组织ColⅣ有微量表达及NF-κB p65有微量活化，模型组ColⅣ表达明显增强（P＜0.01），两治疗组大鼠肾组织ColⅣ表达水平较模型组明显减低（P＜0.05），两治疗组间无明显差异；模型组NF-κB p65阳性信号高表达于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞胞核内。两治疗组的NF-κBp65核阳性细胞数较模型组显著下降（P＜0.05），两治疗组间没有显著性差异。⑦RT-PCR法显示FN mRNA在正常组肾组织有少量表达，在模型组其表达量显著增加（P＜0.01），两治疗组较模型组显著减少（P＜0.05），但较正常组增多。⑧24小时尿蛋白定量与ColⅣ表达量呈正相关关系，相关系数有统计学意义（P＜0.05）。结论：①大鼠心模型制作成功；②中药重楼能不同程度地减轻和清除心大鼠肾小球免疫复合物和细胞外基质（ECM）沉积，降低尿蛋白排泄和降低血胆固醇水平的作用；③NF-κB p65在参与肾小球正常的新陈代谢及其生理功能中具有一定的作用。MN的发生与NF-κB p65的过度活化有密切关系。重楼可能通过调节肾组织NF-κB p65的活化来减轻肾损害。④重楼治疗心大鼠的疗效与雷公藤多甙相当，且部分作用机制相同。第二部分重楼含药血清对系膜细胞增殖、凋亡及分泌纤维连接蛋白的影响目的：观察中药重楼含药血清对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞（MC）异常增殖、凋亡及分泌纤维连接蛋白（FN）的影响，以便从细胞生物学及基因水平探讨重楼防治肾小球疾病的作用机制。为该药合理使用于临床提供理论依据。方法：选用雌雄各半的健康大鼠36只，随机分为正常组，重楼高、中、低剂量组，雷公藤多甙组和强的松组，每组6只。分别灌服蒸馏水或相应的受试药物用于制备正常大鼠血清、重楼（高、中、低剂量）含药血清、对照药雷公藤多甙及强的松含药血清。将各组含药血清分别与脂多糖（LPS）、体外培养的大鼠肾小球MC分别作用12小时、24小时和36小时。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）比色法，观察重楼含药血清对脂多糖刺激肾小球MC增殖的影响；采用Hoechst33258染色、流式细胞仪Annexin V-FITC／PI双染检测大鼠肾小球MC凋亡及凋亡率；采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组细胞上清FN蛋白水平；采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肾小球MC FN mRNA和抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达水平。结果：①CCK-8比色结果显示：脂多糖组与正常组在12小时、24小时和36小时3个时间点的吸光度（OD）值相比均显著增高（P＜0.01），提示脂多糖能促进肾小球MC异常增殖。高、中剂量重楼组及雷公藤多甙组在12小时、24小时和36小时三个时间点的OD值均较脂多糖组显著减低（P＜0.01）；低剂量重楼组12小时时的OD值与脂多糖组比较无显著差异，在24小时和36小时时的OD值均较脂多糖组显著减低（P＜0.01），在24小时时重楼随着剂量的增加，其0D值逐渐减低，3个剂量组两两比较均有显著性差异（P＜0.01 or P＜0.05），提示重楼含药血清和雷公藤多甙含药血清能抑制LPS刺激所致的MC增殖，且重楼含药血清的抑制作用存在一定的量效一时效关系；在36小时时重楼各剂量组的OD值均较24小时时高，提示36小时时其抑增殖作用较前有减弱趋势；强的松组在12小时和24小时两个时间点的OD值均显著低于脂多糖组（P＜0.01），提示强的松含药血清能抑制LPS刺激的肾小球MC增殖，但其抑增殖作用明显弱于高、中、低剂量重楼含药血清及雷公藤多甙含药血清（与重楼高、中剂量组及雷公藤多甙组比较P＜0.01）；在12小时时雷公藤多甙组与重楼高剂量组的抑增殖作用相当，在24小时和36小时时，雷公藤多甙含药血清的抑增殖作用不如高剂量重楼含药血清（P＜0.01 or P＜0.05）。②Hoechst33258染色观察显示正常组MC胞膜完整，胞核染色较深且均一。重楼组的MC胞膜有不同程度的皱缩，染色质聚集，荧光增强，并伴不同形状的碎裂，可见典型的凋亡小体形态。③流式细胞仪Annexin V-FITC／PI双染检测结果显示重楼各剂量组和雷公藤多甙组MC凋亡率较正常组均有显著性增高（P＜0.01）；在重楼各剂量组内，MC凋亡率随重楼剂量的增加而呈递增变化，且重楼中剂量组与重楼低剂量组之间有显著差异（P＜0.01），提示重楼含药血清对MC凋亡的诱导有一定的量效关系；雷公藤多甙组诱导的MC凋亡率显著高于重楼各剂量组（P＜0.01），提示重楼含药血清在一定剂量上诱导MC凋亡的作用弱于雷公藤多甙含药血清；强的松含药血清对MC凋亡无明显影响。④ELISA法测定MC分泌FN的结果显示正常组MC FN的分泌量很少，脂多糖组较正常组MC FN的分泌量显著增加（P＜0.01）；重楼各剂量组、雷公藤多甙组及强的松组均能明显抑制FN的分泌，与脂多糖组相比差异显著（P＜0.01）；随重楼剂量的增加MC分泌FN的水平呈递减变化，且重楼各剂量组间两两比较均有显著性差异（P＜0.01），提示重楼含药血清抑制MC分泌FN有一定的量效关系；雷公藤多甙组和强的松组的OD值显著高于高剂量重楼组（P＜0.01），提示高剂量重楼含药血清抑制MC分泌FN的作用强于雷公藤多甙含药血清和强的松含药血清。⑤RT-PCR显示bcl-2 mRNA和FN mRNA在正常组有少量表达，在脂多糖组两者表达量显著增加（P＜0.01）；对于MC bcl-2 mRNA表达情况，重楼各剂量组与雷公藤多甙组较脂多糖组显著减少，但较正常组增多。雷公藤多甙组、重楼各剂量组与脂多糖组比较有显著性差异（P＜0.01），重楼各剂量组间两两比较均有显著性差异（P＜0.01），且随重楼剂量的增加MC bcl-2 mRNA表达水平呈递减趋势；雷公藤多甙组的平均OD比值显著低于重楼高剂量组（P＜0.01），提示雷公藤多甙含药血清抑制MCbcl-2 mRNA表达作用更强；对于MC FN mRNA表达情况，重楼各剂量组、雷公藤多甙组及强的松组较脂多糖组均显著减低（P＜0.05），重楼各剂量组、雷公藤多甙组及强的松组两两比较无显著性差异，提示低、中和高剂量重楼含药血清与雷公藤多甙含药血清、强的松含药血清对MC分泌FN的抑制作用相当。结论：①重楼含药血清可抑制MC的异常增生及MC过度分泌FN，此可能是重楼治疗肾小球疾病取得临床疗效的内在机制。②重楼含药血清对MC的抑制作用有一定的量效-时效关系，其中、高剂量与雷公藤多甙含药血清的抑增殖作用相当，但高剂量重楼含药血清对MC的抑制作用较雷公藤多甙含药血清持久；低、中、高剂量重楼含药血清抑增殖作用均显著强于强的松含药血清。③重楼含药血清能诱导异常增生的MC凋亡及抑制MC抗凋亡基因bcl-2 mRNA的表达，从而促使增殖的MC消散，进一步提示该中药有减少MC增殖数量的作用，同时部分阐明其诱导MC凋亡的机制；重楼含药血清诱导MC凋亡的作用弱于雷公藤多甙含药血清。④本课题从细胞、细胞因子水平及基因水平再次证实了中医药治疗肾小球疾病的可行性、有效性，表明中医药对肾小球疾病的治疗作用并非仅仅限于改善临床症状、体征及生化指标，除此之外尚有其深刻的内在机制，值得进一步研究。第三部分重楼含药血清对系膜细胞核转录因子-kappaB表达影响的实验研究目的：探讨重楼含药血清对脂多糖（LPS）诱导的肾小球系膜细胞（MC）核转录因子-kappaB（NF-κB）活性的影响。方法：采用血清药理学实验方法和MC体外培养方法，制备重楼和对照药雷公藤多甙及强的松含药血清，将各组含药血清分别与脂多糖、体外培养的大鼠肾小球MC作用24小时，收集细胞用于抽提总RNA，采用RT-PCR检测各组系膜细胞NF-κB mRNA水平。结果：NF-κB mRNA在正常组有少量表达；在脂多糖组NF-κBmRNA表达量显著增加（P＜0.01）；重楼各剂量组、雷公藤多甙组及强的松组较脂多糖组NF-κB mRNA表达量显著减少（P＜0.01）；雷公藤多甙组NF-κB mRNA表达量明显低于重楼各剂量组（P＜0.01 orP＜0.05）：强的松组NF-κB mRNA表达量明显高于重楼高剂量组（P＜0.05）。结论：重楼含药血清、雷公藤多甙含药血清及强的松含药血清均可抑制体外培养MC NF-κB的活化，重楼含药血清抑制MC NF-κB活化的作用弱于雷公藤多甙含药血清，而高剂量重楼含药血清抑制MCNF-κB活化的作用强于强的松含药血清。推测抑制MC中NF-κB的活化可能是重楼发挥肾保护作用的重要机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 中药重楼对膜性肾病大鼠的肾脏保护作用及其机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 重楼含药血清对系膜细胞增殖、凋亡及分泌纤维连接蛋白的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 重楼含药血清对系膜细胞核转录因子-kappaB表达影响的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果