RNAi沉默TGF-β1对抗大鼠移植肾纤维化机制的研究

论文摘要

第一部分目的建立大鼠移植肾纤维化加快模型并转染,观察shRNA-TGF-β1质粒（转化生长因子β1干扰质粒）对大鼠移植肾炎性细胞浸润及纤维化的影响。方法采用强化供肾冷缺血的方法,建立SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体的移植肾纤维化加快模型,将受体分为四组:T组为质粒组,受者注射RNAi质粒;H组为空质粒组,受者注射空质粒;Y组为移植组,受者仅行肾移植,不注射任何质粒;J组为假手术组,只打开腹腔切除左肾,不进行肾移植。并利用流体力学为基础的肾脏基因转染技术进行相应质粒的转染。HE染色评估各组移植肾炎性细胞浸润及纤维化程度。结果成功建立大鼠移植肾纤维化加快模型,移植组肾大鼠较短时间肾脏即纤维化缩小;HE染色示移植肾间质大量淋巴细胞浸润,细胞外充满大量的嗜伊红色细胞外基质,纤维化程度较重;相反质粒组的大鼠移植肾炎性细胞细胞浸润少,纤维化程度较轻。结论强化冷缺血能加快移植肾纤维化;以流体力学为基础的肾脏基因转染技术具有可行性;shRNA-TGF-β1质粒可减轻移植肾炎性细胞浸润及纤维化。第二部分目的:观察shRNA-TGF-β1质粒对大鼠移植肾TGF-β1及ECM（细胞外基质）表达的影响。方法:移植术后1、2、3个月时收集肾脏标本; RT-PCR及Western blot检测TGF-β1,Masson染色观察移植肾细胞外基质的沉积。结果:质粒组TGF-β1表达受到抑制,明显低于移植组及空质粒组（P<0.01 or P<0.05）;质粒组移植肾细胞外基质沉积少于移植组及空质粒组。结论:shRNA-TGF-β1质粒能抑制移植肾TGF-β1的表达,减少细胞外基质的生成,一定程度上预防移植肾纤维化。第三部分目的:探讨shRNA-TGF-β1质粒对抗大鼠移植肾纤维化作用机制。方法:RT-PCR及Western blot检测各组移植肾p-Smad3（磷酸化-Smad3）、p-Smad7（磷酸化-Smad7）、E-cadherin、Ⅰ型胶原的mRNA及蛋白表达;E-cadherin及α肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色分别标记肾小管上皮细胞及成纤维母细胞,观察移植肾上皮细胞及成纤维母细胞变化的情况。结果:质粒组p-Smad3表达受到抑制,低于移植组及空质粒组（P﹤0.01 or P <0.05）;质粒组p-Smad7表达上调,高于移植组及空质粒组（P﹤0.01 or P < 0.05）;质粒组Ⅰ型胶原表达受到抑制,明显低于移植组及空质粒组（P<0.01 or P<0.05）;质粒组E-cadherin表达高于H、Y组（P﹤0.01 or P < 0.05）;质粒组E-cadherin标记的肾小管上皮细胞多于对照组,α-SMA标记的成纤维母细胞少于对照组,发生上皮-间质转分化的细胞较少。结论: shRNA-TGF-β1质粒对抗移植肾纤维化的机制可能是下调信号蛋白p-Smad3的表达、上调p-Smad7的表达,维持E-cadherin的表达,进而抑制了上皮-间质转分化,减少了包括Ⅰ型胶原在内的细胞外基质的生成。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 大鼠移植肾纤维化加快模型的建立及质粒对移植肾纤维化的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 质粒对大鼠移植肾TGF-β1 及ECM 表达的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 质粒对抗大鼠移植肾纤维化作用机制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 全文附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录