论文摘要
目的B细胞淋巴瘤的膜表面免疫球蛋白（surface membrane immunoglobulin,mIg）独特型（idiotype,Id）来自基因重排,由可变区的重链（VH）和轻链（VL）基因所决定,其突出的个体化特征即肿瘤特异性抗原（TSA）正好满足了抗肿瘤疫苗的特异性的需要。将来源于个体的恶性增殖的B细胞的Ig特异性片段VH和VL通过基因克隆制备成单链抗体可变区片段（scFv）,二者由一段短肽连接,可以模拟完整免疫球蛋白的免疫原性。由于scFv源于自身抗原,单独应用不足以诱导抑制肿瘤细胞的免疫反应,为此人们在提高免疫原性方面做了大量的研究。研究者发现利用配体与细胞表面受体的结合可提高抗原呈递给抗原提呈细胞（APC）的效率,提高抗原特异性免疫反应。Biragyn将单核细胞趋化蛋白3（Monocyte chemotactic protein-3,MCP3）与scFv偶联作为疫苗免疫小鼠,发现其表达的融合蛋白具有Ig的天然构象及趋化因子的功能,能和抗原结合,同时吸引抗原提呈细胞（特别是未成熟树突状细胞）向抗原靠近,诱导的免疫反应强于免疫球蛋白疫苗。同时,抗肿瘤的DNA疫苗也是最近研究的一个热点,本研究利用小鼠B细胞淋巴瘤细胞株A20的scFv和MCP3的融合基因构建DNA疫苗,并用该疫苗免疫同源小鼠,LDH法检测小鼠的脾细胞与靶细胞A20孵育后的CTL活性。比较表达scFv和MCP3-scFv的DNA疫苗产生的细胞免疫反应对肿瘤细胞的杀伤效果,探讨融合型独特型DNA疫苗在抗肿瘤免疫反应中是否能诱导T细胞介导的抗肿瘤反应,诱导的抑瘤效果是否高于独特型DNA疫苗,为提高独特型疫苗的免疫原性提供理论基础,为淋巴瘤疫苗的制备及临床试验研究拓宽思路。方法:1真核表达质粒的构建1.1 PCR引物设计根据A20细胞IgVH cDNA、IgVL cDNA与MCP3序列分别设计MCP3-scFv和scFv的上下游引物,此部分实验已经完成[1]。根据EGFP序列设计EGFP上下游引物,序列均来源于Genebank。1.2 PCR扩增目的片段以pGLo/MCP3-scFv为模板,分别用MCP3上游引物和VL下游引物扩增MCP3-scFv,VH上游引物和VL下游引物扩增scFv。以含有EGFP基因序列的质粒PCX-EGFP为模板,分别用引物EGFP上游引物和EGFP下游引物扩增EGFP基因。1.3 pGEM T-easy载体克隆MCP3-scFv、scFv、EGFP片段以及鉴定1.4 DNA质粒构建将PCR产物MCP3-scFv、scFv、EGFP酶切后,定向克隆到真核表达载体pTARGET ,得到真核表达质粒pTARGET/EGFP、pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP,将三种质粒转化感受态细菌及酶切鉴定,选取阳性克隆测序。2质粒转染及鉴定将构建的质粒分别电穿孔法转染至培养至对数生长期的人脐静脉内皮细胞ECV-304,转染后48小时,在倒置荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。3质粒准备和免疫小鼠3.1质粒纯化应用QIAGEN/Endofree Plasmid Maxi,Giga Kit分离纯化质粒pTARGET/EGFP、pTARGET/scFv-EGFP、pTARGET/MCP3-scFv-EGFP。每种质粒内毒素水平控制在0.1 EU/ug以下,制备成为符合动物实验要求的质粒。3.2 DNA疫苗免疫动物将18只Babl/c小鼠按随机区组方法分成三组:pTARGET/EGFP组; pTARGET/scFv-EGFP组;pTARGET/MCP3-scFv-EGFP组。6只/组。在小鼠双侧股四头肌肌内注射2.5g/L盐酸布比卡因,每侧50μl。5天后每组质粒取50微克溶至50微升0.9%NaCL分别注射于小鼠两侧的股四头肌,接种三次,每次间隔两周。4 LDH释放法测定CTL的特异性杀伤率于小鼠免疫结束后第5天取脾细胞作为效应细胞,A20细胞为靶细胞,将效靶比例设置为20/1、50/1、100/1,应用LDH释放法测定CTL活性。5统计学分析CTL的杀伤率数据分析采用SPSS（13.0）统计软件进行,3组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验,P<0.05认为有统计学意义。结果:1真核表达质粒经相应的限制性内切酶酶切鉴定均正确。测序结果显示目的片段基因序列与相关文献报道基本符合。2细胞转染及荧光观察:融合基因真核表达质粒转染ECV后经倒置荧光显微镜下观察发现,pTARGET/EGFP、pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP在转染后48h和72h均表达带较强绿色荧光的蛋白,间接提示融合蛋白成功表达。3各组CTL杀伤率（%）为:效靶比例为100/1时:pTARGET/MCP3-scFv-EGFP组:68.45±5.72 ; pTARGET/scFv-EGFP组:14.20±4.39 ; pTARGET /EGFP组: 10.76±1.02。pTARGET/MCP3-scFv-EGFP组与其它两组比较均有统计学差异（P<0.05）。结论:1成功构建两种DNA疫苗: pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP。2 DNA疫苗免疫动物后可诱导出特异性细胞免疫反应。同时试验证明,与scFv疫苗相比,MCP3与scFv融合的独特型DNA疫苗能诱导高效的抗肿瘤免疫应答。
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