脐橙（Citrus sinensis Osbeck）晚熟芽变性状形成机理研究

论文摘要

奉节晚橙（Citrus sinensis Osbeck）是一个来源奉节72-1脐橙的晚熟芽变品种。这两个品种一起将构成一个很好的柑橘成熟机理研究体系。加强对奉节晚橙的研究，明确奉节晚橙晚熟芽变发生的机理，将为柑橘熟期育种奠定理论基础，最终有助于柑橘产业的持续健康发展。本文研究了奉节晚橙与奉节72-1脐橙在果实成熟过程中的糖酸、色素、以及转录水平的变化，探讨了晚熟芽变脐橙发生原因，取得如下主要结果：1．建立了一种适合于柑橘不同时期不同组织的RNA提取方法。利用该方法所提取的RNA的A260／A280在1.65-1.90之间，A260／A230大于2.0；其质量和浓度能够直接用于其它分子研究，如RT-PCR，cDNA-AFLP和Northern杂交（地高辛）实验。2．着色差异分析表明：与奉节72-1脐橙着色相比，奉节晚橙的转色期约延迟30天左右，造成这种着色延迟的原因主要是奉节晚橙果皮前期叶绿素含量减少进程和后期类胡萝卜素积累进程推迟所致。奉节晚橙果皮的叶绿素含量显著减少发生在11月上旬到11月下旬，迟于奉节72-1品种，后者叶绿素含量显著降低发生在10月中下旬到11月上旬；奉节晚橙果皮的类胡萝卜素含量显著积累始于12月中旬，而奉节72-1品种则始于11月初。另外奉节晚橙果皮中叶绿素含量在10至11月间显著高于原品种，类胡萝卜素含量在12至1月间显著低于原品种。基因表达分析发现，奉节晚橙果皮的类胡萝卜素合成酶的相关基因较强表达的时间也整体迟于奉节72-1脐橙；叶绿素水解酶基因表达在10至12月中旬其表达强度较奉节72-1脐橙弱，翌年1月份则有较强的表达。3．通过对果实成熟过程中的糖分积累分析表明，奉节晚橙和奉节72-1脐橙果实在成熟过程中两个品种的糖分变化差异主要发生在果肉组织，且奉节晚橙果肉中三种糖分含量在12月中旬之前是显著低于奉节72-1脐橙果肉中的糖分含量，而在元月份后则明显高于后者；果皮中奉节晚橙的蔗糖含量在果实成熟前期两个时期（10月11日和11月3日）显著低于奉节72-1脐橙。而蔗糖相关代谢酶基因表达分析表明，两个品种果肉中酸性转化酶和蔗糖合酶的基因表达表现明显差异，这种差异部分影响了奉节晚橙和奉节72-1果实间的糖分差异。4．奉节晚橙和奉节72-1脐橙果肉酸积累分析发现奉节晚橙在成熟前期柠檬酸含量显著高于奉节72-1脐橙，而在后期（11月底始）则低于后者；在果实成熟中期，奉节晚橙节果酸含量显著低于对照品种。柠檬酸代谢相关酶基因表达分析表明柠檬酸合成酶和顺乌头酸酶基因表达在两个品种间表现差异，而造成奉节晚橙柠檬酸含量与奉节72-1的差异可能与此时奉节晚橙果肉中柠檬酸合酶基因表达较强和顺乌头酸酶基因表达受抑制相关。5．利用分子标记技术，SSR和AFLP对两个品种的DNA差异进行分析，未发现两个品种间在DNA水平上可重复的差异。6．采用cDNA-AFLP技术分析了两个品种的果实在成熟过程中转录水平的表达，并对cDNA-AFLP的结果进行了进一步验证。实验筛选了120对选择性引物，总共获得近20000多条清晰带，结果发现其中有34对引物出现差异带，检测到144条清晰的转录差异带（TDFs）。在成功回收的129个TDFs中，通过测序和序列比对（Blastx）分析表明表达差异片段主要与信号转导、转录因子、成熟衰老、抗逆性、核糖体蛋白和DNA复制等有关。7．利用RACE技术，以cDNA-AFLP技术获得的差异片段为基础克隆了6个与成熟相关的基因，分别命名为CitPG（EF185420）、CitCAD（EF185415）、CitMads（EF185417）、CitMAP（EF185418）、CitNAC（EF185419）、CitEREBP（EF185416），除了MADs-box基因外，其它5个目前在柑橘中还未见报道，且CitMads与目前报道的柑橘Mads-box基因序列不同。表达分析表明在果实成熟过程中，他们在两个品种的果皮或果肉组织中有表达差异，可能与晚熟性状的表现有关。以上研究结果表明，相对奉节72-1脐橙，奉节晚橙在许多方面发生了改变，这种性状的改变很显然不是因为某一相关指标因子发生突变而引起局部性状发生改变，而确实是果实成熟过程或发育过程整体延迟所致。而导致这种整体改变可能是在表达水平上而非在DNA水平发生改变。由于果实成熟是一个综合而又复杂的过程，而非跃变型柑橘果实是一个渐进式的程序性过程，因此要使奉节晚橙整体协调发生改变，那么这种改变的发生很有可能在果实发育过程或成熟过程发生的上游某个阶段，即可能是启动果实成熟开始的一个‘开关’发生变化，从而导致奉节晚橙成熟过程整体表现延迟。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 课题提出和文献综述
• 1.1 课题提出
• 1.2 果实成熟调控研究进展
• 1.2.1 果实成熟概念和类型
• 1.2.2 果实成熟调控
• 1.2.2.1 激素在果实成熟调控中作用
• 1.2.2.2 光照在果实成熟调控中的作用
• 1.2.2.3 转录因子在果实成熟过程中的调控作用
• 1.2.2.4 果实成熟过程中糖酸代谢调控及糖分在植物发育过程中的调控作用
• 1.2.2.5 果实成熟过程中的色素积累调控
• 1.2.2.6 果实成熟过程中其他方面的调控
• 1.2.3 研究果实成熟的策略
• 1.2.3.1 差异性研究技术
• 1.2.3.2 EST技术
• 1.2.3.3 microRNA技术
• 1.2.3.4 转基因验证
• 1.3 芽变的研究进展
• 1.3.1 芽变基础
• 1.3.2 芽变机理研究策略
• 1.3.2.1 分子标记在研究芽变方面的应用
• 1.3.2.2 差异显示研究技术
• 1.3.2.3 基因全长克隆技术
• 1.3.3 果实成熟期芽变研究状况
• 1.4 本研究的目的和意义，以及研究内容和路线
• 1.4.1 研究目的和意义
• 1.4.2 研究内容和路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 DNA提取
• 2.2.2 RNA的提取
• 2.2.2.1 RNA提取试剂或溶液
• 2.2.2.2 RNA提取步骤
• 2.2.3 色度指标和色素测定
• 2.2.4 色素相关代谢酶基因的半定量RT-PCR分析
• 2.2.5 糖分和酸含量测定
• 2.2.6 糖分和酸代谢相关酶基因的半定量RT-PCR分析
• 2.2.7 核基因组SSR分析
• 2.2.8 基因组AFLP分析
• 2.2.9 cDNA-AFLP分析
• 2.2.10 差异片段克隆，测序及比对
• 2.2.11 差异表达片段的RT-PCR分析
• 2.2.12 RACE克隆基因全长
• 2.2.13 地高辛（DIG） Northern杂交
• 2.2.13.1 RNA转膜
• 2.2.13.2 地高辛（DIG）杂交
• 2.2.13.3 洗膜
• 2.3 数据处理
• 3 结果分析
• 3.1 果实RNA提取结果
• 3.1.1 其他几种RNA提取方法的评价
• 3.1.2 改进RNA提取方法的RNA提取质量评价
• 3.2 奉节晚橙成熟过程中色素代谢分析
• 3.2.1 果实成熟时期及果皮颜色差异
• 3.2.2 果皮叶绿素和类胡萝卜素的含量变化
• 3.2.3 与色素代谢有关酶的基因表达
• 3.3 奉节晚橙成熟过程中糖酸代谢分析
• 3.3.1 果实糖分在成熟过程中变化
• 3.3.2 果实在成熟过程中蔗糖代谢相关酶基因分析
• 3.3.3 果肉中柠檬酸和苹果酸含量在成熟过程中变化
• 3.3.4 果肉中柠檬酸代谢相关酶基因在成熟过程中的表达变化
• 3.4 基因组SSR和AFLP分析
• 3.4.1 基因组的SSR分析
• 3.4.2 基因组的AFLP分析
• 3.5 果实成熟过程中的cDNA-AFLP分析
• 3.5.1 差异片段的统计和功能归类
• 3.5.2 部分差异片段的RT-PCR或Northern验证，以及差异表达分析
• 3.6 有关基因全长克隆及分析
• 3.6.1 柑橘多聚半乳糖醛酸酶基因（CitPG）全长克隆及分析
• 3.6.2 柑橘NACdomain基因（CitNAC）全长克隆及分析
• 3.6.3 柑橘肉桂醇脱氢酶基因（CitCAD）全长克隆及分析
• 3.6.4 柑橘促分裂原活化蛋白激酶基因（CitMAP）全长克隆及分析
• 3.6.5 柑橘乙烯应答单元结合蛋白基因（CitEREBP）全长克隆及分析
• 3.6.6 柑橘MADs-box基因（CitMads）全长克隆和分析
• 4 讨论
• 4.1 RNA提取方法
• 4.2 奉节晚橙和奉节72-1成熟过程中生理差异原因探讨
• 4.2.1 着色差异原因探讨
• 4.2.2 糖含量差异原因探讨
• 4.2.3 酸含量差异原因探讨
• 4.3 转录水平差异探讨
• 4.3.1 SSR和AFLP的非差异结果探讨
• 4.3.2 cDNA-AFLP技术有效性及结果探讨
• 4.3.3 克隆的相关基因与成熟关系探讨
• 4.4 晚熟芽变性状形成机理探讨
• 参考文献
• 致谢
• 附录I-奉节晚橙和奉节72-1脐橙在成熟过程中的色泽变化
• 附录II-03-04年度奉节晚橙和奉节72-1脐橙相关生理指标分析
• 附录III 博士期间发表的论文