猪RIG-I，IRG-6基因的克隆及其在抗猪流感病毒中的作用

论文摘要

流感病毒属于正黏病毒科,易变异、难预防,能跨越物种屏障传播,给动物养殖和人类健康带来了巨大的挑战与威胁。当前养殖业中对流感的控制主要依赖于疫苗和药物,但这已不能满足现代社会对绿色无公害食品的需求,更不能从源头上解决流感感染和传播的问题。因此通过筛选抗流感病毒候选基因、研究它们的功能及作用,再利用这些基因、通过转基因育种技术培育抗流感的转基因动物新品种,提高动物对流感的抵抗力是未来预防流感的重要方向。本研究中,在前期抗流感基因芯片筛选结果的基础上,结合抗病基因研究进展,以天然免疫信号通路为研究切入点,对猪RIG-I、IRG-6基因的结构、分子特征、抗流感作用及对细胞抗病毒信号通路的诱导激活作用做了初步研究。主要研究内容有以下几个方面：1.猪RIG-Ⅰ基因的克隆及功能鉴定（1）克隆了猪RIG-I基因的N端、C端和全长序列,进行了序列分析,绘制了系统发生树。构建了猪RIG-I的N端、C端和全长的真核表达载体,用Real-Time PCR技术及血凝和血凝抑制实验检测了接毒后不同时间点细胞和上清中流感病毒的增殖情况。结果表明,猪RIG-I的不同区段对猪流感H1N1的复制均具有抑制效果,接毒后24h抑制效果最好,N端对猪流感H1N1病毒的抑制作用最明显。（2）为验证猪RIG-I对鸡胚成纤维细胞抗病毒信号通路的诱导激活作用,采用Real-Time PCR检测CEF细胞中转染猪RIG-I不同区段对鸡抗病基因的诱导作用。结果表明,猪RIG-I的N端、C端和全长均能显著上调IFNβ, Mx1及PKR基因的mRNA水平,其中,N端的上调效果最明显,全长其次。在检测的几个基因中,Mxl的上调倍数最大,证实了猪RIG-I可以显著提高鸡的抗病毒能力。（3）用Western blot验证了猪RIG-I的N端能在DF1细胞中表达。（4）构建了荧光蛋白融合表达质粒pEGFP-RIG-I-N,通过荧光的观察,证明了CMV启动子能在DF1细胞中表达,且猪RIG-I的N端和GFP荧光蛋白能在DF1细胞中融合表达。（5）成功构建了猪RIG-I的N端与荧光蛋白融合表达的逆转录病毒载体RCASBP-RIG-I-GFP,为下阶段在鸡胚上的验证工作奠定基础。2.猪IRG-6基因的克隆及功能鉴定（1）克隆了猪IRG-6基因全长序列,进行了序列分析,绘制了系统发生树。构建了真核表达载体pCMV-IRG-6。（2）用Real-Time PCR技术及血凝和血凝抑制实验检测接毒后不同时间点细胞上清中流感病毒的增殖情况。结果表明,猪IRG-6超表达显著抑制猪流感H1N1病毒的增殖,接毒后42h抑制作用最明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 猪流感的流行病学特征及其危害
• 1.2.1 流感病毒的结构特征
• 1.2.2 流感病毒的分类
• 1.2.3 甲型流感病毒的蛋白种类和功能
• 1.2.4 流感病毒的生活史与致病机理
• 1.2.5 猪流感的危害
• 1.3 转基因抗病育种研究进展
• 1.3.1 抗病育种
• 1.3.2 转基因技术及其在抗病育种上的应用
• 1.4 抗病毒天然免疫反应
• 1.4.1 天然免疫系统的组成和机制
• 1.4.2 模式识别受体及其对病毒的识别
• 1.5 RIG-Ⅰ研究进展
• 1.5.1 RIG-Ⅰ结构和功能
• 1.5.2 RIG-Ⅰ与病毒间的互作
• 1.6 干扰素及其诱导的主要抗病毒蛋白
• 1.6.1 干扰素
• 1.6.2 Mx蛋白
• 1.6.3 双链RNA依赖性蛋白激酶
• 1.6.4 2’-5’寡聚腺苷合成酶
• 1.7 IRG-6研究进展
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 细胞和病毒
• 3.1.2 载体与菌株
• 3.1.3 主要试剂与试剂盒
• 3.1.4 主要试剂的配制
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.1.6 分子生物学分析软件
• 3.1.7 主要数据库和网站
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 目的基因或片段的克隆
• 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 PCR产物或酶切产物的回收、纯化与测序
• 3.2.4 外源DNA片段与目的载体的连接反应
• 3.2.5 连接产物的转化
• 3.2.6 质粒的制备与鉴定
• 3.2.7 菌种的保存
• 3.2.8 细胞培养与质粒转染（脂质体介导转染法）
• 3.2.9 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达
• 50)的测定'>3.2.10 半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)的测定
• 3.2.11 细胞的接毒
• 3.2.12 细胞、感染病毒的细胞样品总RNA的提取
• 3.2.13 cDNA的合成
• 3.2.14 实时定量PCR
• 4 结果与分析
• 4.1 猪RIG-Ⅰ基因的克隆及功能鉴定
• 4.1.1 猪RIG-Ⅰ基因的克隆
• 4.1.2 猪RIG-Ⅰ的序列分析
• 4.1.3 猪RIG-Ⅰ的系统发生树
• 4.1.4 猪RIG-Ⅰ真核表达载体的构建
• 4.1.5 超表达猪RIG-Ⅰ对猪流感病毒增殖的影响
• 4.1.6 猪RIG-Ⅰ诱导激活鸡RLR信号通路及逆转录病毒载体构建
• 4.2 猪IRG-6基因的克隆及功能鉴定
• 4.2.1 猪IRG-6基因的克隆
• 4.2.2 猪IRG-6的序列分析
• 4.2.3 猪IRG-6的系统发生树
• 4.2.4 猪IRG-6真核表达载体的构建
• 4.2.5 超表达猪IRG-6对猪流感病毒增殖的影响
• 5 讨论与小结
• 5.1 讨论
• 5.1.1 猪RIG-Ⅰ、IRG-6的克隆和序列分析
• 5.1.2 猪RIG-Ⅰ对猪流感病毒增殖的影响
• 5.1.3 猪RIG-Ⅰ在鸡成纤维细胞中的研究
• 5.1.4 猪IRG-6对猪流感病毒增殖的影响
• 5.2 小结
• 参考文献
• 致谢