混合菌种生物技术（MCB）光合产氢的试验研究

论文摘要

随着能源的日益紧张以及环境污染的日益严重，作为清洁能源的氢能的研究逐渐受到重视。相对于传统的制氢方法，生物产氢由于低能耗、高效率、无污染以及可再生等优点而备受关注。其中光合生物产氢集太阳能利用、可再生资源利用、有机废弃物处理以及产氢相联合，将成为最有潜力的产氢技术。认识光合微生物产氢的规律，能动地利用这些客观规律指导能源工作，同时也是地球生态平衡、物质循环极为重要的一个环节。混合菌种是值得重视并需要加强研究和利用的微生物资源。混合菌种多种类细菌间发生协同效应，使代谢产物不易积累，相互创造有利的生存环境，使各菌种的代谢活性充分发挥，从而提高了混合菌种的产氢能力。混合菌种生物技术（MCB，mixed culturebiotechnology）可以成为超越基于传统单一纯菌株生产化学产物或者／和生物能源的生物技术的一种新的选择。与工业化生物技术的纯菌株相对比，利用混合菌种生物技术（MCB）光合产氢具有以下优点：不需要灭菌；由于微生物的多样性具有很强的适应能力；对于多种底物具有适应能力以及持续生产过程的可能性。本文对从沼气池活性污泥富集培养出以多种光合细菌为主的混合菌种进行了光合产氢的实验研究，同时以纯菌种沼泽红假单胞菌Rh．Palustris Z02作了相应的对比试验，并利用修正的Gompertz方程进行产氢动力学分析。结果表明，混合菌种比纯菌种的光合细菌表现出更好的产氢能力和更高的稳定性。尤其在对蔗糖和可溶性淀粉的利用上，混合菌种对这两种碳源的利用比较充分，产氢率分别为3．47 mol H2／mol蔗糖和6．68 mmol H2／g可溶性淀粉，氢气含量分别为83．30％和76．06％，且气相中没有甲烷气产生。此外，对各种参数，如pH、温度、接种量以及光强等对产氢率的影响进行了研究。表明混合菌种的产氢条件较Rh．Palustris Z02更为宽松。同时利用Arrhenius模型较好地反映混合菌种产氢速率与反应温度的关系。本文同时对影响光合细菌产氢的固氮酶的三大调控因素：气相条件、NH4+、二价铁系金属离子对混合菌种生物技术（MCB）光合产氢影响进行了试验研究。结果表明气相中大量的O2对固氮酶以及氢酶的毒害导致无法产氢，而微量O2的存在却能对产氢有促进作用，尤其是在Ar与微量O2的混合气相条件下，产氢率达到最高的2．38molH2／mol乙酸钠，且产氢延迟期最短。同时发现气相条件对混合菌种产氢较纯菌种Rh．Palustris Z02的影响小。通过pH值的控制与不控制时不同NH4+浓度的对比产氢试验，发现不控制pH值时，NH4+对混合菌种光合产氢的抑制作用显著；而控制pH=7．0时，适当低浓度的NH4+可以提高混合菌种的光合产氢率以及产氢速率。无论是否控制pH值，只有NH4+被菌体的生长所消耗掉，才开始产氢，这表明NH4+对产氢的抑制作用在一定范围内是可恢复的。同时通过混合菌种与纯菌株Rh．Palustris Z02的对比试验发现，无论对于生长还是产氢，NH4+对混合菌种的影响均小于对纯菌株Rh．Palustris Z02的影响。二价铁系金属离子Fe2+、Co2+和Ni2+作为金属酶的辅基对光合细菌的生长和产氢有重要的作用。通过对不同浓度的Fe2+，Co2+和Ni2+对光合细菌的生长与产氢的影响实验研究发现，适当浓度的二价铁系离子对产氢具有一定的促进作用，Fe2+，Co2+和Ni2+最佳产氢浓度分别为9μmol／L、0．45μmoI／L和0．1μmol／L。对产氢的影响作用大小顺序为：Fe2+>Ni2+>Co2+。二价铁系离子在适当的浓度范围内可提高生长速率，其中Co2+对生长的促进作用最大。pH值影响二价铁系离子对固氮酶活性的作用，当pH=7．0时，Fe2+浓度的变化对产氢的影响最显著。随着pH值偏离7．0，Fe2+浓度的变化对产氢的影响逐渐减小。碳源与氮源的种类和数量也是影响产氢活性的重要因素。通过对混合菌种利用不同氮源和碳源进行的产氢试验，确定了适合混合菌种光合产氢的氮源和碳源，并进一步确定了产氢最佳的C／N浓度比。本文最后通过对模拟含淀粉废水进行光合产氢的试验研究，确定了淀粉产氢的影响因素。结果发现淀粉浓度是影响光合产氢的一个主要因素，虽然淀粉是混合菌种光合产氢的非抑制性底物，即提高淀粉浓度可以提高产氢量，但对于产氢率来说则是随着淀粉浓度的增高而逐渐减小的，所以产氢过程中如何确定淀粉浓度，还需要综合考虑产氢速率、产氢延迟期等相关参数。结果表明混合菌种利用含淀粉废水光合产氢是可行的。本文同时对反应的菌液进行了DNA提取、纯化以及PCR扩增，通过对DGGE图谱分析，发现混合菌种利用淀粉光反应和暗反应产氢的样品条带在数量和亮度上都存在一定的差异，说明暗反应条件下产氢的优势菌群要略多于光合反应的菌群。

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摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 引言

1.1.1 能源问题

1.1.2 环境问题

1.2 氢能的开发

1.2.1 氢能的特点

1.2.2 氢能生产技术

1.3 生物产氢的研究

1.3.1 生物产氢的途径

1.3.2 生物产氢机理

1.3.2.1 光合生物法产氢

1.3.2.2 发酵法产氢

1.3.3 生物产氢的研究现状及发展趋势

1.3.3.1 产氢机制及影响因子的研究

1.3.3.2 高效菌株的筛选

1.3.3.3 利用有机废弃物和废水进行生物产氢

1.3.3.4 充分利用太阳能进行生物产氢

1.3.3.5 生物反应器的研究

1.4 混合菌种产氢的意义

第2章混合菌种生物技术（MCB）及产氢的技术综述

2.1 引言

2.2 混合菌种生物技术（MCB）的文献综述

2.2.1 混合菌种生物技术（MCB）的特点

2.2.2 微生物的混合培养

2.2.2.1 HSB（High Solution Bacteria）技术

2.2.2.2 EM（Effective Microorganisms）技术

2.2.3 混合菌种的生物降解

2.2.4 混合菌种的生物产能技术

2.2.4.1 环境生物技术与工业生物产能技术的对比

2.2.4.2 混合菌种生物产多羟（基）链烷酸酯（或盐）（PHAs）技术

2.2.4.3 混合菌种生物产甲烷技术

2.2.4.4 混合菌种生物产氢技术

2.3 混合菌种生物技术（MCB）产氢的研究综述

2.3.1 混合菌种发酵产氢的技术综述

2.3.2 混合菌种光合产氢的技术综述

2.3.3 混合菌种产氢的发展趋势

2.4 本文的研究意义、目的及研究内容

2.4.1 研究意义

2.4.2 研究目的及内容

第3章混合菌种的富集培养及其生理特性研究

3.1 混合菌种的富集培养

3.1.1 富集培养的目标

3.1.2 选择分离源

3.1.3 分离样品的破碎、分散处理

3.1.4 富集培养基

3.1.5 富集培养方法

3.1.6 富集培养过程中培养液pH的变化

3.2 混合菌种的生理特性

3.2.1 生长系统及分析方法

3.2.1.1 生长系统

3.2.1.2 菌体的生长曲线测定方法

3.2.2 混合菌种的生长动力学模型的建立

3.2.3 不同培养基下混合菌种的生长特性

3.2.3.1 生长培养基的选择

3.2.3.2 自来水与蒸馏水条件下的菌体生长对比

3.2.4 混合菌种的生长特性

3.2.4.1 初始pH对混合菌种生长的影响

3.2.4.2 不同温度对混合菌种生长的影响

3.2.4.3 不同光强对混合菌种生长的影响

3.2.5 生长过程pH的变化

2S的耐受性以及耐盐性'>3.2.6 对Na₂S的耐受性以及耐盐性

3.3 本章小结

第4章混合菌种的光合产氢特性分析

4.1 引言

4.2 产氢系统及分析方法

4.2.1 产氢培养基（g/L）

4.2.2 产氢系统

4.2.3 分析方法

4.2.3.1 气体成份分析

4.2.3.2 液体成份分析

4.2.3.3 还原糖的测定

4.3 产氢过程动力学模型的建立

4.3.1 产氢动力学模型

opt'>4.3.2 产氢速率方程及最大产氢速率对应的时间t_opt

4.3.3 底料降解动力学模型

4.3.4 热动力学分析

4.4 混合菌种的产氢特性

4.4.1 累积产氢量及产氢率

4.4.2 产氢速率

4.4.3 产氢过程中菌体的生长

4.4.4 底料降解

4.4.5 反应过程pH的变化

4.4.6 产生气体中氢气的含量

4.4.7 初始pH对混合菌种光合产氢的影响

4.4.8 温度对混合菌种光合产氢的影响

4.4.9 光强对混合菌种光合产氢的影响

4.4.10 接种量对混合菌种光合产氢的影响

4.4.11 搅拌对混合菌种产氢的影响

2S浓度对混合菌种光合产氢的影响'>4.4.12 Na₂S浓度对混合菌种光合产氢的影响

4.5 本章小结

第5章混合菌种光合产氢影响因素分析

5.1 气相条件的影响

5.1.1 试验系统及分析方法

5.1.1.1 产氢培养基（g/l）

5.1.1.2 光合产氢系统

5.1.1.3 高纯气体气相条件的产氢试验用气

5.1.1.4 混合气体为初始气相条件的产氢试验

5.1.1.5 菌体的生长测定

5.1.1.6 气体成分的测定与液相成分分析

5.1.2 高纯气相条件下的菌体的光合生长与产氢

5.1.2.1 高纯气相对生长的影响

5.1.2.2 高纯气相对产氢的影响

5.1.3 混合气体气相条件下的光合产氢

5.1.3.1 混合气相对产氢的影响

5.1.3.2 混合气相对生长的影响

5.1.4 底物降解动力学及底物利用率

5.1.5 不同气相条件下反应过程中的pH变化

5.1.6 本节小结

4⁺对混合菌种的生长及光合产氢的影响'>5.2 NH₄⁺对混合菌种的生长及光合产氢的影响

5.2.1 产氢系统及分析方法

5.2.1.1 生长系统

5.2.1.2 光合产氢系统

5.2.1.3 菌体的生长测定

5.2.1.4 气体成分的测定与液相成分分析

4⁺的测量'>5.2.1.5 NH₄⁺的测量

4⁺浓度对混合菌种生长的影响'>5.2.2 NH₄⁺浓度对混合菌种生长的影响

4⁺浓度对混合菌种生长的影响'>5.2.2.1 NH₄⁺浓度对混合菌种生长的影响

4⁺浓度对混合菌种与纯菌种Rh.Palustris Z02生长影响的对比'>5.2.2.2 NH₄⁺浓度对混合菌种与纯菌种Rh.Palustris Z02生长影响的对比

4⁺浓度对产氢的影响'>5.2.3 NH₄⁺浓度对产氢的影响

4⁺浓度对混合菌种产氢率的影响'>5.2.3.1 NH₄⁺浓度对混合菌种产氢率的影响

4⁺浓度对混合菌种产氢速率的影响'>5.2.3.2 NH₄⁺浓度对混合菌种产氢速率的影响

4⁺浓度对混合菌种与纯菌种Rh.Palustris Z02产氢影响的对比'>5.2.3.3 NH₄⁺浓度对混合菌种与纯菌种Rh.Palustris Z02产氢影响的对比

5.2.4 本节小结

5.3 二价铁系离子对产氢和生长的影响

5.3.1 试验系统及分析方法

5.3.1.1 产氢培养基

5.3.1.2 试验系统

5.3.1.3 菌浊和生物量的测量

5.3.1.4 气体成份和液相成份的分析测定

5.3.2 对产氢和生长的影响

5.3.2.1 对产氢的影响

5.3.2.2 二价铁系离子对菌体生长的影响

5.3.2.3 比产氢速率、比生长速率及产氢延迟期

2+浓度变化对产氢的影响'>5.3.3 初始pH不同时，Fe²⁺浓度变化对产氢的影响

5.3.4 本节小结

5.4 本章小结

第6章碳源与氮源对混合菌种光合产氢的影响

6.1 引言

6.2 碳源对混合菌种光合产氢的影响

6.2.1 不同碳源的产氢特性

6.2.1.1 产氢系统及分析方法

6.2.1.2 单糖与低聚糖的测定

6.2.1.3 产氢特性

6.2.1.4 氢转化率及产生生物气中的氢气含量

6.2.2 产氢过程中菌体的生长特性

6.2.3 尾液分析及产氢过程的pH变化

6.2.4 碳源浓度对产氢的影响

6.2.5 本节小结

6.3 氮源对产氢的影响

6.3.1 不同氮源对产氢的影响

6.3.1.1 产氢特性

6.3.1.2 不同氮源对生长的影响

6.3.2 谷氨酸钠浓度对产氢的影响

6.3.2.1 不同谷氨酸钠浓度对累积产氢量的影响

6.3.2.2 不同谷氨酸钠浓度产氢过程中混合菌种的生长特性

6.4 C/N比对混合菌种光合产氢的影响

6.4.1 试验设计

6.4.2 累积产氢量

6.4.3 产氢率

6.4.4 C/N浓度比对产氢率影响的验证

6.5 本章小结

第7章混合菌种利用模拟含淀粉废水的产氢

7.1 引言

7.2 产氢系统及分析方法

7.2.1 产氢系统

7.2.2 分析方法

7.2.2.1 气相成份分析与液相成份分析

7.2.2.2 还原糖的测定

7.2.2.3 单糖与低聚糖的测定

7.2.3 DNA提取、PCR扩增及DGGE电泳分离

7.3 混合菌种利用模拟淀粉废水的产氢

7.3.1 混合菌种与纯菌株利用模拟含淀粉废水产氢的对比

7.3.2 混合菌种利用模拟含淀粉废水光合产氢pH范围的确定

7.3.3 产氢过程中的热动力学分析

7.3.3.1 温度的影响

7.3.3.2 基于Arrhenius方程的热动力学分析

7.3.4 淀粉浓度对光合产氢的影响

7.3.5 不同淀粉浓度时混合菌种光合产氢过程反应液pH变化

7.3.6 本节小结

7.4 混合菌种利用淀粉在光照及黑暗条件下的产氢

7.4.1 光反应与暗反应条件下的动态产氢特性

7.4.2 动态产氢速率模型及最优产氢时间

7.4.3 光反应与暗反应下pH变化

7.4.4 光反应与暗反应产氢时菌群的DGGE分析

7.4.5 光反应与暗反应条件下淀粉浓度对产氢的影响

7.4.6 本节小结

7.5 本章小结

第8章全文总结及下一步研究展望

8.1 结论

8.2 创新点

8.3 本文不足及建议

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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