两种脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达及其对旧报纸脱墨的评价

论文摘要

脂肪酶是一种重要的工业用酶，在食品、化工、医药和造纸工业都有广泛的应用。近年来，随着世界的资源短缺以及人们对环境保护的日益重视，生物酶在造纸工业的应用受到广泛的关注。脂肪酶在造纸工业上的应用主要集中在废纸脱墨和树脂控制这两方面。研究表明，使用脂肪对废纸进行脱墨，不但脱墨效果较好，而且可以显著减少化学制剂如烧碱、硅酸钠、双氧水的使用，对纸浆纤维无损伤，大大减轻污水处理的压力，综合成本显著降低。然而，目前市场上专门用于脱墨的商品酶还很少，而且效果也不尽如人意，这就阻碍了脂肪酶在造纸工业上的广泛应用。本研究以克隆表达能适应脱墨工艺要求的脂肪酶为目的，克隆表达了两种耐碱性的脂肪酶基因。研究了其酶学性质，并对其脱墨效果做了评价，发现这两种脂肪酶均具备较强的脱墨能力，具体研究内容如下：1、从本实验室保存的质粒pMD18-BSL中克隆了一条来自枯草芽孢杆（Acinetobacterradioresistens）的碱性脂肪酶基因BSL，构建了pPICZαA-BSL分泌型重组质粒，该重组质粒经限制性内切酶pmeI线性化后使用LiCl法转化到毕赤酵母X-33，经过筛选获得分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-BSL。摇瓶发酵液上清酶活最高可达4.78U/ml，研究了该脂肪酶的基本酶学性质，发现其最适作用温度为40-60℃，最适pH为9.0，且具有高度耐碱的特性。2、从本实验室保存的质粒pMD18-ARL中克隆了一条来自抗辐射不动杆菌（Bacillussubtilis）的碱性脂肪酶基因BSL，亚克隆到表达载体pPICZαA，构建了分泌型载体pPICZαA-ARL，转化毕赤酵母X-33，经筛选获得能分泌表达脂肪酶的重组酵母X-33/pPICZαA-ARL，摇瓶发酵液上清最高酶活可达60U/ml，其最适作用pH为9.0，最适作用温度为50℃。3、使用这两种脂肪酶进行了旧报纸脱墨研究，并与两种商品酶以及化学法脱墨进行了比较，发现在洗脱法脱墨评价中，BSL和ARL这两种脂肪酶脱墨效果均优于商品酶；4、检测了不同酶法脱墨浆及化学法脱墨浆的物理强度性能发现，脂肪酶脱墨浆的强度高于以纤维素酶和木聚糖酶为主要成分的商品酶，更是明显高于化学法脱墨浆，且酶法脱墨的废水污染特性明显优于化学法脱墨废水。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶的来源与特征
• 1.1.1 脂肪酶的来源
• 1.1.2 脂肪酶的结构特征
• 1.1.3 脂肪酶催化的反应类型
• 1.1.4 脂肪酶的底物特异性
• 1.2 脂肪酶基因的克隆与表达
• 1.2.1 脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 1.2.2 脂肪酶基因在大肠杆菌中的表达
• 1.2.3 脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
• 1.3 毕赤酵母表达系统
• 1.4 脂肪酶在废纸脱墨中的应用
• 1.4.1 油墨的成分
• 1.4.2 油墨的印刷方式
• 1.4.3 脱墨过程
• 1.4.4 脂肪酶脱墨机理
• 1.4.5 脂肪酶脱墨研究现状
• 1.4.6 脂肪酶脱墨的优势
• 1.5 本课题研究的意义与内容
• 第二章 枯草芽孢杆菌脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 分子克隆用酶和试剂
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 实验仪器设备
• 2.2.6 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 脂肪酶基因 BSL 的克隆
• 2.3.2 重组质粒 pPICZαA-BSL 的构建
• 2.3.3 重组毕赤酵母的构建和筛选
• 2.3.4 重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定
• 2.3.5 重组毕赤酵母发酵液上清的 SDS-PAGE 分析
• 2.3.6 重组脂肪酶 BSL 的酶学性质分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 抗辐射不动杆菌脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 分子克隆用酶和试剂
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 实验仪器设备
• 3.2.6 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 脂肪酶基因 ARL 的克隆
• 3.3.2 重组质粒 pPICZαA-ARL 的构建
• 3.3.3 重组毕赤酵母的构建和筛选
• 3.3.4 重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定
• 3.3.5 重组毕赤酵母发酵液上清的 SDS-PAGE 分析
• 3.3.6 重组脂肪酶 ARL 的酶学性质分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 两种脂肪酶在旧报纸脱墨上的评价
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 ARL 脱墨工艺初探
• 4.3.2 BSL 脱墨工艺初探
• 4.3.3 两种重组脂肪酶与商品脱墨酶脱墨能力的比较
• 4.3.4 不同酶脱墨浆及化学法脱墨浆的物理性能的比较
• 4.3.5 不同酶脱墨与化学法脱墨废水水质污染特性的比较
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 1. 结论
• 2. 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件