桦褐孔菌胞外多糖液体深层发酵及木质纤维素促进产糖效果的研究

论文摘要

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）是一种珍稀食药用真菌,其子实体和发酵菌丝体中含有多种生物活性物质,具有广泛的开发应用价值。桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌含有的重要生物活性物质,具有对多种氧化活性自由基的清除和免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等活性。本论文的研究目的是建立桦褐孔菌液体深层发酵活性胞外多糖的培养体系。首先研究了在发酵基础培养基基础上桦褐孔菌液体深层发酵的特性。进一步利用统计学方法,以发酵胞外多糖的羟基自由基清除活性为指标优化液体发酵培养基,在此基础上加入木质纤维素作为发酵后续碳源,明确了桦褐孔菌在液体发酵过程中对纤维素、半纤维素和木质素的降解可提高发酵胞外多糖产量和多糖对羟基自由基的清除活性。而且木质纤维素培养基来源的桦褐孔菌发酵胞外多糖具有最强的清除超氧自由基和抑制脂质过氧化的活性。该培养体系获得的发酵胞外多糖为β构型,由甘露糖（46.65%）、葡萄糖（11.39%）、半乳糖（35.10%）和少量的鼠李糖（2.98%）、阿拉伯糖（2.07%）和木糖（0.91%）组成。1.对桦褐孔菌菌株（Inonotus obliquus CBS 314.39）的原始菌种进行活化纯培养。对Mea平板菌落,菌丝形态进行观察,并按照真菌保藏方法保藏。在发酵基础培养基的基础上研究了生物量、还原糖、发酵总糖等各项发酵参数的变化,确定发酵周期9天。2.利用统计方法对桦褐孔菌液体发酵培养基进行了优化,确定了培养基组分及各组分的浓度。首先利用单因素试验确定了玉米粉和蛋白胨为最优碳氮源,再次用部分因子试验设计,筛选出了玉米粉、蛋白胨及KH2PO4对发酵胞外多糖的羟基自由基清除活性有显著性影响,然后用响应面法对筛选出的主要因子进行优化,并最终确定了经过优化的培养基的组成（% w/v）:玉米粉,5.30;蛋白胨,0.32;KH2PO4,0.26;MgSO4, 0.15; CaCl2,0.01。优化培养基后,桦褐孔菌发酵胞外多糖的羟基自由基清除率达到了49.4%,比发酵基础培养基和单因素优化培养基分别提高了385%和39%。3.重点研究了木质纤维素对桦褐孔菌发酵胞外多糖产量和羟基自由基清除活性的促进作用。实验结果表明,木质纤维素的加入显著提高了桦褐孔菌发酵胞外多糖的产量,使多糖的产量由无木质纤维素发酵基础培养基的1.09g/L提高到1.37g/L,同时使发酵胞外多糖的最高羟基自由基清除率由无木质纤维素培养基的72.3%提高到82.7%。4.比较研究了三种液体发酵培养基来源（基础培养基、加木质纤维素培养基、木质纤维素+硫脲培养基）的胞外多糖的红外光谱性质和单糖组成。结果表明所得三种多糖的苷键为β构型,主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和少量的鼠李糖、阿拉伯糖和木糖组成,但三种来源多糖中相同组成单糖所占的比例不同。对超氧自由基的清除活性和对小鼠肝脏自发脂质过氧化的抑制作用,木质纤维素培养基来源的桦褐孔菌发酵胞外多糖的活性最高,木质纤维素+硫脲发酵培养基来源的多糖活性次之,无木质纤维素发酵基础培养基来源的多糖活性最低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 食药用真菌多糖的性质、结构
• 1.2 桦褐孔菌及桦褐孔菌多糖简介
• 1.3 桦褐孔菌多糖的抗氧化活性
• 1.3.1 各种活性氧化自由基的危害
• 1.3.2 多糖抗氧化机理及桦褐孔菌多糖的抗氧化活性
• 1.4 桦褐孔菌多糖的其他生物活性
• 1.5 桦褐孔菌液体深层发酵的研究现状
• 1.6 桦褐孔菌液体深层发酵多糖提取方法的研究现状
• 1.7 白腐真菌对木质纤维素的分解作用
• 1.7.1 木质纤维素生物质简介
• 1.7.2 白腐真菌对木质纤维素材料的降解
• 1.8 木质纤维素的降解与胞外多糖积累的关系
• 1.9 本论文的研究思路及主要内容
• 参考文献
• 第二章 原始菌种的活化纯培养、保藏及常规液体深层发酵
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 原始菌种
• 2.2.1.2 试剂
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 实验仪器及设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 活化纯培养
• 2.2.2.2 菌落及菌丝形态观测
• 2.2.2.3 菌种的保藏
• 2.2.2.4 斜面菌种平板扩大培养
• 2.2.2.5 液体发酵菌种的制备
• 2.2.2.6 液体深层发酵基本参数的摸索
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌落、菌丝及孢子形态观察
• 2.3.2 液态菌种的制备
• 2.3.3 液体深层发酵基本情况的摸索
• 2.3.3.1 生物量随时间的变化
• 2.3.3.2 发酵液中还原糖随时间的变化
• 2.3.3.3 桦褐孔菌发酵胞外多糖含量随时间的变化
• 2.3.3.4 桦褐孔菌发酵胞外多糖羟基自由基清除率随时间的变化
• 2.4 小结
• 参考文献:
• 第三章 响应面法优化桦褐孔菌液体发酵产活性胞外多糖培养基
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 原始菌种
• 3.2.1.2 试剂
• 3.2.1.3 培养基
• 3.2.1.4 实验仪器及设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 液体发酵菌种的制备
• 3.2.2.2 摇瓶发酵
• 3.2.2.3 桦褐孔菌发酵胞外多糖的提取纯化
• 3.2.2.4 桦褐孔菌发酵胞外多糖羟基自由基清除率测定
• 3.2.2.5 液态发酵培养基优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 最佳碳源和氮源的筛选
• 3.3.2 培养基组分中对发酵胞外多糖羟基自由基清除活性的影响
• 3.3.3 最陡爬坡试验接近最大响应面区域
• 3.3.4 中心组合设计和响应面分析确定培养基组分浓度
• 3.3.5 验证试验
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 木质纤维素对桦褐孔菌发酵胞外多糖产量和羟基自由基清除活性的促进作用
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 菌种
• 4.2.1.2 试剂
• 4.2.1.3 培养基
• 4.2.1.4 主要实验仪器与设备
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 液体发酵菌种的制备
• 4.2.2.2 摇瓶发酵
• 4.2.2.3 桦褐孔菌发酵胞外多糖的提取纯化
• 4.2.2.4 分析方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 发酵过程中MDA 浓度变化
• 4.3.2 发酵过程中木质纤维素三种组分的含量变化
• 4.3.2.1 地衣酚法标准曲线
• 4.3.2.2 蒽酮硫酸法标准曲线
• 4.3.2.3 纤维素、半纤维素、木质素残留率随发酵时间的变化规律
• 4.3.3 三种培养基中桦褐孔菌发酵胞外多糖的含量随时间的变化
• 4.3.4 三种培养基中桦褐孔菌发酵胞外多糖羟基自由基清除活性测定
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 桦褐孔菌发酵胞外多糖性质及抗氧化活性的初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.1.1 主要试剂
• 5.2.1.2 试验仪器及设备
• 5.2.2 试验方法
• 5.2.2.1 胞外多糖的红外光谱分析
• 5.2.2.2 胞外多糖的单糖组成
• 2·）清除率的测定'>5.2.2.3 胞外多糖对超氧自由基（O₂·）清除率的测定
• 5.2.2.4 胞外多糖抗小鼠肝脏自发脂质过氧化能力的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 胞外多糖红外光谱试验
• 5.3.2 胞外多糖的单糖组成
• 2·）清除率的测定'>5.3.3 超氧自由基（O₂·）清除率的测定
• 5.3.4 胞外多糖抗小鼠肝脏自发脂质过氧化能力的测定
• 5.4 小结
• 参考文献
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 致谢
• 硕士期间发表的论文