论文题目: mRNA体外展示技术筛选胸苷酸合成酶RNA亲和肽的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 阎松
导师: 林秀坤
关键词: 胸苷酸合成酶,体外展示,筛选,亲和肽
文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是生物体内催化胸苷酸合成所必需的酶,多年来一直作为肿瘤化疗的重要靶酶。对TS基因调控机制的研究表明:基因扩增、转录、翻译和翻译后过程都参与了TS表达的调控。除具催化活性外, TS还是一种RNA结合蛋白,TS可与自身的mRNA结合形成TS-mRNA复合物,使mRNA翻译受阻。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)等抗代谢药物可与TS蛋白结合,结合后的复合物不能与TS mRNA作用,使上述负反馈调控机制丧失,导致体内TS的表达升高,这种翻译自调控模型是肿瘤细胞产生抗药性的重要分子机制之一。应用展示技术筛选不同功能的核酸、肽和蛋白是近年的研究热点,目前应用的展示技术包括噬菌体展示技术、核糖体展示技术及mRNA体外展示技术等。mRNA体外展示是一种新兴的高效多肽选择技术,其基本原理是通过含嘌呤霉素寡核苷酸的Linker使mRNA与它编码的肽或蛋白共价结合,形成mRNA-蛋白质融合体,从而实现基因表型(RNA)与蛋白表型(多肽)的结合。这一方法已用于多种功能肽的鉴定。以mRNA体外展示技术进行了由大容量多肽库中(>1013)筛选胸苷酸合成酶RNA亲和肽的研究,通过合理的实验设计,建立了一套完整有效的筛选方法,并对实验时机、条件进行了优化,对文库构建、融合肽生成及筛选方法等问题也作了探讨。对随机库进行了12轮循环的选择及扩增,并对第8个和第12个循环的选择肽进行了测序及二级结构预测。结果表明,与初始库相比,选择循环之后碱性氨基酸含量明显增加,而且一半以上的序列含有碱性氨基酸对,芳香族氨基酸中的苯丙氨酸含量也明显增加。选择肽中碱性及芳香族残基的增加必然在TS RNA与蛋白的相互作用中扮演着重要角色。12轮循环选择肽的完全随机序列中,第12位的精氨酸占53%; 按理化特性对每一随机位点的氨基酸进行分类,并与初始库比较,发现位点1,12,17和18具有明显的带正电荷的特性,表明碱性侧链参与了RNA的结合。二级结构预测表明,随着筛选的进行,与TS RNA亲和的多肽显示出明
论文目录:
摘要
Abstract
引言
第一部分文献综述
第一章胸苷酸合成酶表达调控的分子机制
1. 基因扩增
2. 转录调控
3. 翻译调控
4. 翻译后调控
5. 小结与展望
第二章展示技术的原理与应用
1. 体内展示技术—噬菌体展示技术
1.1 噬菌体展示系统的建立
1.2 噬菌体展示系统的类别
1.3 噬菌体展示肽库的筛选方法
1.4 噬菌体肽库的构建和多肽的进化
1.5 噬菌体展示技术的应用
1.6 前景
2 体外选择技术—核糖体展示技术,mRNA 体外展示技术
2.1 体外选择技术建立基础
2.2 基本原理
2.3 具体方法
2.4 特点
2.5 研究动态与应用前景
2.6 结语
第二部分mRNA 体外展示技术筛选胸苷酸合成酶RNA 亲和肽的研究
第三章mRNA 体外展示技术筛选胸苷酸合成酶RNA 亲和肽的方法
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2. 结果与讨论
2.1 随机DNA 库的构建
2.2 融合肽的生成
2.3 以固定化靶RNA 筛选功能肽
2.4 测序
3 小结
第四章胸苷酸合成酶RNA 亲和肽的结构与功能
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2. 结果与讨论
2.1 mRNA 体外展示过程
2.2 测序结果分析
2.3 二级结构预测
2.4 RNA-蛋白结合试验
2.5 选择肽的翻译抑制效果
3 小结
第三部份 结论
参考文献
发表文章
致谢
发布时间: 2006-04-28
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