慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对结肠癌生物学行为的影响

论文摘要

恶性肿瘤的发生发展过程涉及多个趋化因子和受体的异常表达,CXCL12和受体CXCR4是肿瘤生长和转移的关键因子。最近在前列腺癌的研究中发现仅抑制CXCR4的表达,只能部分地阻断恶性肿瘤的生长、转移。进一步研究发现,CXCR7（孤儿受体RDC1）与CXCL12具有高亲和力,表达于许多肿瘤细胞系,直接参与调节肿瘤的发生发展。CXCR7信号传导机制还不确切,推测可能是通过结构性激活机制来活化细胞,此结构性激活机制通过可逆性地与配体结合的形式活化。体外实验证实CXCR7能提高肿瘤细胞的生长、粘附和侵袭能力。导入CXCR7序列的乳腺癌细胞MDA-MB435s,体内成瘤性显著提高;而CXCR7siRNA可使乳腺癌细胞4T1体内成瘤性显著降低。用CXCR7的小分子拮抗剂也可使肿瘤生长显著减小。目前研究CXCR7对肿瘤生物学行为的影响仅限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。本文拟展开“CXCR7与结肠癌”的实验研究,首先假定CXCR7是人结肠癌发生发展的促进因子,在结肠癌组织中高表达,并与结肠癌细胞的增殖、迁移相关,靶向沉默CXCR7的表达能有效抑制结肠癌的恶性进展,由此实验研究设计如下:1.研究CXCR7在人结肠癌组织、正常结肠组织以及结肠癌细胞系中的表达,探讨其表达水平与淋巴结转移以及肿瘤分化程度的关系。2.设计、筛选有效抑制人结肠癌细胞CXCR7表达的siRNA序列,并构建重组慢病毒CXCR7shRNA（lentiviraus-CXCR7shRNA,LV-CXCR7shRNA）表达载体。3.研究靶向CXCR7的慢病毒shRNA表达载体对人结肠癌细胞增殖、迁移活性的调节作用,从细胞水平探讨CXCR7对结肠癌的生物学行为的影响。4.研究靶向CXCR7的慢病毒shRNA表达载体对人结肠癌荷瘤裸鼠瘤体的治疗作用,在动物体内进一步证实CXCR7对结肠癌的生物学行为的影响。第一章CXCR7在人结肠癌组织和结肠癌细胞系中的表达及其意义目的研究CXCR7在人结肠癌组织、正常结肠组织以及结肠癌细胞系中的表达水平。方法1.CXCR7在人结肠癌组织中的表达水平:分别采用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）和Westernblotting（WB）方法测定人结肠癌组织和正常结肠组织中CXCR7mRNA和蛋白的表达水平,结合临床资料分析CXCR7的表达水平与淋巴结转移和肿瘤分化程度的关系。2.CXCR7在人结肠癌细胞系中的表达水平:FQ-PCR方法测定CXCR7mRNA在2种人结肠癌细胞系HT-29和SW480中的表达水平,选择其中CXCR7表达较高的一株结肠癌细胞进入后续部分的实验。结果1.人结肠癌组织和正常结肠组织中CXCR7mRNA相对表达的中位数分别为1.14和0.22,差异有统计学意义（P＜0.05）。结肠癌组织中CXCR7蛋白的相对表达量为0.245±0.059,与正常结肠组织中的0.17±0.064相比差异有统计学意义（P＜0.05）。2.在伴有和不伴有淋巴结转移的结肠癌组织中,CXCR7mRNA相对表达的中位数分别为1.455和0.74,差异有统计学意义（P＜0.05）;CXCR7蛋白的相对表达量分别为0.276±0.055和0.2±0.026,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.在不同分化程度的肿瘤组织中,CXCR7mRNA和蛋白的表达无显著性差异（P＞0.05）。4.CXCR7mRNA在人结肠癌细胞系HT-29中的表达水平高于在SW-480中的表达水平。结论1.CXCR7在人结肠癌组织中的表达显著增高,并且在伴有区域淋巴结转移的结肠癌组织中表达上调。2.在不同分化程度的结肠癌组织中,CXCR7的表达无差异。3.HT-29细胞中CXCR7mRNA的表达较高。第二章构建CXCR7shRNA重组慢病毒表达载体目的筛选有效的CXCR7siRNA序列,构建重组慢病毒CXCR7shRNA表达载体。方法1.筛选有效抑制人结肠癌细胞CXCR7表达的siRNA序列:设计3个针对CXCR7靶基因序列的siRNA序列,分别构建重组shRNA质粒,小量包装shRNA慢病毒载体,并转染人结肠癌细胞HT-29,FQ-PCR和WB方法分别测定转染后HT-29细胞中CXCR7mRNA和蛋白的表达水平,证实沉默效果,筛选出有效靶点。2.构建LV-CXCR7shRNA:用所筛选出的siRNA序列构建重组shRNA质粒,大量包装LV-CXCR7shRNA,并检测病毒滴度。结果1.FQ-PCR检测3个siRNA序列对CXCR7基因的沉默效应,其中以LV-CXCR7shRNA-2下调最为明显（72%）,WB检测结果与其一致。2.选择沉默效应为72%的siRNA序列包装shRNA慢病毒载体,测定病毒滴度为4.0×108TU/mL。结论成功构建慢病毒CXCR7shRNA表达载体,可有效下调人结肠癌HT-29细胞中CXCR7mRNA和蛋白的表达。第三章靶向抑制CXCR7的表达对人结肠癌细胞生物学特性的影响目的研究靶向抑制CXCR7的表达对人结肠癌细胞增殖、迁移活性的影响。方法1.将人结肠癌细胞HT-29分为3组:实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组加入LV-CXCR7shRNA;阴性对照组加入LV-shRNA阴性对照;空白对照组不予任何处理。2.FQ-PCR和WB方法分别测定各组细胞CXCR7mRNA和蛋白的表达水平3.细胞活性实验（MTT）、Transwell细胞迁移实验检测各组细胞的增殖和迁移活力。结果1.CXCR7mRNA和蛋白的表达水平:FQ-PCR结果显示实验组CXCR7mRNA的相对表达水平低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）,而两组对照组之间相比较无显著性差异（P＞0.05）。WB结果与FQ-PCR一致,提示LV-CXCR7shRNA对HT-29细胞的CXCR7基因沉默有效。2.细胞活性实验（MTT）:结果显示实验组细胞生长曲线较平缓,细胞生长速度较阴性对照组和空白对照组显著降低（P＜0.05）;阴性对照组细胞生长曲线较空白对照组低平,提示靶向沉默CXCR7的表达明显抑制结肠癌细胞的增殖活性,同时慢病毒载体本身具有的潜在细胞毒性。3.Transwell细胞迁移实验:结果显示实验组穿透滤过膜细胞数量较阴性对照组和空白对照组明显减少（P＜0.05）,两对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。结果提示靶向抑制CXCR7的表达明显抑制人结肠癌细胞HT-29的迁移活性。结论靶向沉默CXCR7的表达抑制结肠癌细胞增殖和迁移活性第四章CXCR7shRNA重组慢病毒表达载体对人结肠癌荷瘤裸鼠皮下种植瘤的治疗作用目的探讨慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对人结肠癌裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用,为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗奠定基础。方法1.建立人结肠癌荷瘤鼠模型,计算成瘤率。2.动物分组:将人结肠癌荷瘤裸鼠随机分为3组,每组8只:治疗组:瘤体内注射LV-CXCR7shRNA 50μL;阴性对照组:瘤体内注射LV-shRNA negative control 50μL;空白对照组:瘤体内注射PBS 50μL。3.给药后各组裸鼠每3天测量荷瘤裸鼠肿瘤体积,绘制瘤体增长曲线。4.24天后处死动物,取出种植瘤,测量其体积、重量,计算抑瘤率。5.FQ-PCR和WB方法分别测定肿瘤组织的CXCR7mRNA和CXCR7蛋白表达水平。结果1.人结肠癌荷瘤鼠模型构建成功,成瘤率为100%。2.与阴性对照组和空白对照组比较,治疗组瘤体的增长速度慢、体积小（P＜0.05）,重量减轻（P＜0.05）,抑瘤率分别为38%和34.04%。3.治疗组的瘤体组织中CXCR7mRNA和蛋白的表达水平低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）,阴性对照组和空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05）,提示瘤体内注射靶向CXCR7shRNA慢病毒表达载体能有效下调荷瘤鼠瘤体组织中CXCR7的表达。结论CXCR7-shRNA慢病毒表达载体能显著抑制人结肠癌荷瘤裸鼠的瘤体生长。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英汉缩略词对照表
• 前言
• 第一章:CXCR7在人结肠癌组织及细胞系中的表达及其意义
• 前言
• 技术路线
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实时荧光定量PCR检测CXCR7mRNA的表达
• 1.2.2 Western blotting检测CXCR7蛋白的表达
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 CXCR7mRNA的表达
• 2.1.1 总RNA浓度、纯度及质量鉴定结果
• 2.1.2 人结肠癌组织和正常结肠组织中CXCR7mRNA的表达
• 2.1.3 CXCR7mRNA的表达与结肠癌临床病理因素分析
• 2.1.4 人结肠癌细胞系HT-29和SW-480中CXCR7mRNA的表达
• 2.2 CXCR7蛋白的表达
• 2.2.1 人结肠癌组织和正常结肠组织中CXCR7蛋白的表达
• 2.2.2 CXCR7蛋白的表达与结肠癌临床病理因素分析
• 3 讨论
• 小结
• 第二章:构建CXCR7shRNA重组慢病毒表达载体
• 前言
• 技术路线
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 筛选有效抑制人结肠癌细胞CXCR7表达的siRNA序列
• 1.2.2 CXCR7shRNA慢病毒表达载体的大量包装与纯化
• 1.2.3 慢病毒载体滴度测定
• 2 结果
• 2.1 筛选有效抑制人结肠癌细胞CXCR7表达的siRNA序列
• 2.1.1 Plvthm-CXCR7shRNA重组质粒的DNA测序
• 2.1.2 小量CXCR7shRNA慢病毒表达载体的包装
• 2.1.3 在目的细胞中筛选有效的CXCR7siRNA干扰序列
• 2.2 大量包装的慢病毒表达载体LV-CXCR7shRNA滴度测定
• 3 讨论
• 小结
• 第三章:靶向抑制CXCR7的表达对人结肠癌细胞生物学特性的影响
• 前言
• 技术路线
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 人结肠癌细胞HT-29的培养
• 1.2.2 实验分组
• 1.2.3 细胞转染
• 1.2.4 实时荧光定量PCR检测各组HT-29细胞CXCR7mRNA的表达
• 1.2.5 Western-blotting检测各组HT-29细胞CXCR7蛋白的表达
• 1.2.6 噻唑蓝法（MTT）检测各组HT-29细胞的增殖能力
• 1.2.7 Transwell细胞迁移实验
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 慢病毒载体转染HT-29细胞的效率
• 2.2 各组HT-29细胞中CXCR7mRNA的表达
• 2.3 各组HT-29细胞中CXCR7蛋白的表达水平
• 2.4 噻唑蓝法（MTT）检测细胞的增殖能力
• 2.5 Transwell细胞迁移实验
• 3 讨论
• 小结
• 第四章:CXCR7shRNA重组慢病毒表达载体对人结肠癌荷瘤裸鼠皮下种植瘤的治疗作用
• 前言
• 技术路线
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 人结肠癌动物模型的建立及分组
• 1.2.2 给药后瘤体的体积与抑瘤率分析
• 1.2.3 实时荧光定量PCR测定瘤体组织中CXCR7mRNA表达
• 1.2.4 Western-blotting测定瘤体组织中CXCR7蛋白的表达
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 瘤体内给药后的肿瘤体积
• 2.2 瘤体内给药后24天的瘤重和抑瘤率
• 2.3 瘤体组织中CXCR7mRNA的表达水平
• 2.4 瘤体组织中CXCR7蛋白的表达水平
• 3 讨论
• 小结
• 结论
• 创新与意义
• 参考文献
• 综述
• 综述1:趋化因子受体CXCR与肿瘤相互关系的研究进展
• 参考文献
• 综述2:结直肠癌及其微转移的现代医学诊断技术
• 参考文献
• 综述3:抗独特型抗体疫苗与肿瘤治疗
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间获奖和主要研究成果