论文摘要
目的构建原核表达系统，表达内含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒样颗粒。该病毒样颗粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌体衣壳蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶（RNase）特性，使其替代酶免检测中酶的显色反应，通过RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）来提高对表面抗原（HBsAg）检测的灵敏度。方法本研究采用一种称为免疫-RT-PCR（IRTPCR）的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）报告系统对蛋白抗原进行检测，首先构建原核表达系统，表达内含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒样颗粒，拟选用5’-UTR区作为MS2噬菌体的包装序列，引物5′端引入HindⅢ酶切位点。与用HindⅢ酶切的表达载体pNCCL1相连接，构建一新的表达载体pNCCL1-HCV。在IPTG诱导下，衣壳蛋白会在携带有pET-MS2-HCV的细菌中表达，并与reRNA组装成病毒样颗粒。在immuno-RT-PCR这个反应体系中，包裹特定RNA的重组MS2噬菌体颗粒与传统ELISA中和特异抗体相连的报告基团相似，同样可以形成三明治夹心复合物，通过加热使结合在固相的armored RNA裂解，释放出特异的RNA，可以通过RT-PCR进行检测。结果本研究得到的表达载体pET-MS2-HCV及原核表达系统，可以作为构建和制备耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的平台。通过RT-PCR可以提高免疫检测的灵敏度。采用HBsAg作为三明治夹心中的待测抗原进行实时免疫RT-PCR，与传统的酶联免疫吸附实验相比，检测的灵敏度提高了10000至100000倍。可以用不同的armored RNA采用多重实时RT-PCR的方法同时检测多种不同的靶抗原。这种方法可以作为一种新的超灵敏的免疫检测方法应用于临床诊断以及科研。结论成功构建得到了质粒驱动的包装系统，经原核表达得到了内含HCV reRNA的病毒样颗粒。成功的进行了病毒样颗粒与单克隆抗体的交联，得到了能够用于检测的mAb-armored RNA的结合物，从而使对HBsAg的检测灵敏度提高了10000倍。