葛根素调节支架内狭窄炎症反应的机制研究

论文摘要

目的与背景:1987年支架在临床实践中的应用是经皮冠状动脉介入治疗（percutanenous coronary intervention,PCI）领域中的一个里程碑,其后的10余年来,冠状动脉支架植入术成为冠心病（coronary heart disease,CHD）治疗中一种有确切疗效的重要手段,但相当高（10 %50 %）的支架内再狭窄（in-stent restenosis,ISR）率限制了支架植入术的发展。随着可在局部缓慢释放抑制血管平滑肌细胞增殖药物的药物涂层支架（drug eluting stent,DES）的应用, ISR率明显降低,大大延缓了支架术后再次行PCI的时间。目前,临床常用的有雷帕霉素涂层支架和紫杉醇涂层支架。但药物涂层支架的使用也面临许多问题。如支架运用的远期疗效,以及昂贵的价格等。因此,有必要寻求一种疗效较好,价格合适的药物涂层支架。从支架洗脱药物的角度来说,葛根素具有以下优势:（1）为异黄酮,具有脂溶性,能在组织中长期存留;（2）抑制血管平滑肌细胞增殖,促进血管平滑肌细胞凋亡;（3）促进内皮细胞修复;（4）抗炎作用;（5）抑制血小板聚集。所以,以上特点表明,葛根素具有防治支架术后再狭窄的可能性。所以我们采用中药葛根素涂层支架进行动物实验,并与裸支架、PC涂层支架以及临床应用的国产雷帕霉素涂层支架(FirebirdTM)进行比较,观察葛根素对家兔髂动脉支架植入术后再狭窄的疗效,探讨葛根素药物涂层支架能否有效抑制内膜增生,能否抑制支架内再狭窄的发生;并进一步通过体外实验考察葛根素能否有效保护血管内皮细胞,抑制炎症反应,从而在早期阻断再狭窄的发生和发展,并初步探讨其作用机制。方法与结果:本实验分为三个部分:1葛根素对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）炎性损伤后修复保护作用研究方法:（1）HUVEC的分离培养及鉴定;（2）噻唑蓝（MTT）比色法测定葛根素对体外培养的白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）损伤后HUVEC增殖和活性的影响;（3）硝酸还原酶法测定葛根素对IL-1β损伤后HUVEC分泌一氧化氮（Nitric oxide,NO）的影响;（4）放免法测定葛根素对IL-1β损伤后HUVEC分泌内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）影响;结果:高、中、低三剂量组葛根素均能保护内皮细胞,提高HUVEC活性。其中葛根素浓度10-3mol·L-1时,能明显提高内皮细胞活性（P<0.01）; IL-1β可使细胞培养上清液中NO含量减少,ET-1含量升高,与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01）。葛根素高、中、低三剂量组均可使NO含量增加,与模型组比较有显著性差异（P<0.01）。其中,葛根素高、中剂量组可使ET-1含量降低,与模型组比较有显著性差异（P<0.01）。但葛根素低剂量组降低ET-1含量作用不明显,与模型组比较,无差异性。2葛根素对炎性损伤后HUVEC的细胞因子表达及炎性细胞黏附迁移的影响方法:（1）采用ELISA法检测内皮细胞培养液上清中的单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）,白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）,肿瘤坏死因子-α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）,E-选择素（Endothelium-selectin,E-slectin）的含量;（2）采用黏附实验的方法检测葛根素对HUVEC和U937单核细胞黏附的影响;（3）采用Transwell法,检测葛根素对U937单核细胞迁移的影响;（4）采用Westernblot分析葛根素对内皮细胞核转录因子NF-κBP65活化以及对P-IκBα的影响。结果:细胞ELISA法观察到:IL-1β刺激下,HUVEC的粘附分子E-selectin、趋化因子MCP-1、炎症因子IL-6、TNF-α的表达量增高。葛根素能降低炎性损伤后HUVEC的E-selectin、MCP-1、IL-6、TNF-α表达量;黏附实验证实,IL-1β刺激下,HUVEC与U937单核细胞的黏附增强,葛根素能抑制HUEVC与U937单核细胞的黏附;趋化迁移实验证实,内皮细胞经IL-1β作用后对U937单核细胞趋化作用增强,而加入葛根素后,可减少U937细胞的迁移数目;westen blot实验显示:IL-1β刺激HUVEC,诱导IκBα磷酸化,提高NF-κB活性,葛根素能抑制IκBα磷酸化,阻止内皮细胞NF-κB的活化过程。3家兔髂动脉支架植入术观察葛根素涂层支架的疗效。方法:行家兔髂动脉支架植入术,四周后处死,取支架植入处血管切片。前期实验已经证实,葛根素能抑制家兔髂动脉新生内膜的增生,并且免疫组化也显示,葛根素能促进内皮细胞内皮细胞生长因子（VEGF）表达增多,降低炎性因子IL-6表达。在此基础上,本实验采用免疫组化法进一步观察组织中NF-κBP65,MCP-1蛋白表达情况。结果:与裸支架组比较,葛根素涂层支架能降低家兔髂动脉再狭窄模型中,髂动脉内MCP-1、NF-κB的表达量（P<0.05）结论:支架内再狭窄的形成机制复杂,炎症反应作为一个复杂的互相影响的网络式反应,是支架术后再狭窄发展过程中的重要因素。通过以上三部分实验结果证实:1.葛根素对血管内皮细胞的损伤有保护作用,并能调节内皮细胞活性物质的分泌,保护内皮细胞的功能。2.葛根素通过抑制血管内皮细胞中与炎症反应密切相关的核转录因子NF-κB的表达,从而抑制其下游的表达产物:粘附分子、趋化因子及炎症因子的表达,进而抑制单核细胞与血管内皮细胞的黏附迁移,阻断炎症的进一步发展。3.整体实验显示葛根素涂层支架可以抑制家兔髂动脉再狭窄模型中血管内膜的增生,其机制可能与葛根素上调内皮细胞VEGF的表达,促进内皮细胞修复的功能以及葛根素抑制NF-κB等炎症因子,从而降低支架内再狭窄的炎症发生有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语表
• 上篇 文献回顾
• 综述一 葛根素的药理作用及其临床运用概况
• 综述二 冠状动脉支架内再狭窄的炎症机制研究
• 下篇 实验研究
• 前言
• 第一部分 葛根素对HUVEC炎性损伤后保护作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第二部分 葛根素抗炎作用机理的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第三部分 葛根素涂层支架预防家兔髂动脉内膜增殖的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 讨论
• 参考文献
• 结语
• 致谢
• 个人简历