论文摘要
大量证据表明,摄入植物性食物特别是蔬菜和水果,能够降低各种癌症的发病风险。植物性食物含有的多种生物活性物质（植物化学成分）,是其发挥抗癌活性的重要成分。类黄酮化合物是广泛存在于食用性植物中的多酚类化合物,根据化学结构可分为黄酮醇化合物、黄酮化合物、黄烷酮化合物、黄烷醇化合物、花色苷化合物、异黄酮化合物、二氢黄酮醇化合物以及查耳酮化合物等。许多体内外研究、流行病学调查以及某些临床应用结果表明,类黄酮化合物对于癌症的预防和治疗具有积极作用。但是,类黄酮化合物发挥抗癌活性的内在分子机制,仍有待进一步研究。世界范围内,食管癌在恶性肿瘤中排位第九,约占胃肠癌发病总数的7%,是所有肿瘤中最具致死性的癌症之一。食管癌主要包括两种类型,食管鳞癌（占食管癌总数的90%以上）和食管腺癌（占食管癌总数的10%以下）。大量流行病学研究结果表明,食管癌的发生不仅与饮酒、吸烟、致癌物的摄入以及热损伤直接相关,而且与食物中蔬菜和水果的摄入不足存在密切关系。膳食类黄酮化合物作为蔬菜和水果中的生物活性成分,很可能会为食管癌的预防带来新的希望。本课题研究化学结构相似的黄酮和黄酮醇化合物,对人食管鳞癌细胞系KYSE-510细胞和人食管腺癌细胞系OE33细胞的抑制作用。MTT分析结果表明,黄酮化合物（木犀草素、芹菜素和白杨素）和黄酮醇化合物（槲皮素、山奈酚和杨梅素）,均能以剂量-效应和时间-效应依赖方式,抑制KYSE-510和OE33细胞增殖。它们对KYSE-510和OE33细胞增殖的抑制活性强弱顺序分别为:木犀草素＞槲皮素＞白杨素＞山奈酚＞芹菜素＞杨梅素和槲皮素＞木犀草素＞白杨素＞山奈酚＞芹菜素＞杨梅素。上述结果表明,这些化合物分子中的3’-OH可能有助于黄酮和黄酮醇化合物对KYSE-510和OE33细胞的增殖抑制活性,而分子中的4’-OH和3-OH可能降低化合物抗癌活性的发挥。同时,黄酮化合物和黄酮醇化合物对KYSE-510和OE33细胞的增殖抑制活性,不依赖于分子中的-OH总数。流式细胞仪检测结果显示,黄酮化合物和黄酮醇化合物能够诱导KYSE-510和OE33细胞的周期循环停滞于G2/M期,并且化合物对KYSE-510和OE33细胞G2/M周期停滞的诱导活性强弱顺序与MTT检测结果一致,表明黄酮化合物和黄酮醇化合物可能通过诱导细胞周期停滞,抑制两株食管癌细胞增殖。另外,DNA片段化检测和吖啶橙荧光染色结果显示,KYSE-510和OE33细胞经黄酮化合物和黄酮醇化合物作用后,两株细胞均出现了细胞凋亡的典型特征,表明两类化合物能够诱导KYSE-510和OE33细胞发生细胞凋亡。采用FITC-annexin V和PI双荧光标记,通过流式细胞仪定量比较两类化合物对KYSE-510和OE33细胞的凋亡诱导活性,相应实验数据显示,黄酮化合物和黄酮醇化合物对两株食管癌细胞的凋亡诱导活性强弱顺序,与其G2/M细胞周期停滞的诱导活性强弱顺序以及细胞增殖抑制活性强弱顺序完全一致,表明黄酮化合物和黄酮醇化合物可通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡,实现对两株人食管癌细胞增殖的有效抑制。为探明黄酮化合物和黄酮醇化合物抑制KYSE-510和OE33细胞的分子机制,采用基因芯片技术检测两株食管癌细胞中基因的表达改变。结果表明,KYSE-510细胞经木犀草素作用后,表达改变倍数大于1.5的基因共有75个,其中与细胞增殖、细胞周期循环和细胞凋亡相关的上调表达基因有3个(p21waf1、PIG3和egr-1),下调表达基因有5个（cyclin B1、PSCA、vav3、WISP2和ear-1）;OE33细胞经槲皮素作用后,表达改变倍数大于1.5的基因共有52个,其中与细胞增殖、细胞周期循环和细胞凋亡相关的上调表达基因有4个（PIG3、GADD45β、p18和14-3-3s）,下调表达基因有3个（cyclin B1、PSCA和FBP1）。为验证两株食管癌细胞中基因表达的芯片检测结果,采用荧光定量RT-PCR对上述KYSE-510细胞中的8个基因以及OE33细胞中的7个基因的mRNA表达水平进行分析,并比较6种黄酮、黄酮醇化合物对各基因表达的调控能力。各基因表达的荧光定量RT-PCR分析结果,与相应基因芯片的分析结果相符,表明基因芯片分析结果较为准确可靠。荧光定量RT-PCR分析结果还显示,在KYSE-510细胞中,黄酮化合物和黄酮醇化合物对3个基因(p21waf1、PIG3和cyclin B1)表达的调控活性强弱,对应于其G2/M细胞周期停滞和细胞凋亡的诱导活性强弱;在OE33细胞中,黄酮化合物和黄酮醇化合物对4个基因（PIG3、GADD45B、14-3-3s和cyclin B1）表达的调控活性强弱,对应于其G2/M细胞周期停滞和细胞凋亡的诱导活性强弱。上述结果说明,KYSE-510细胞中的p21waf1、PIG3和cyclin B1以及OE33细胞中的PIG3、GADD45B、14-3-3s和cyclin B1为介导黄酮和黄酮醇化合物诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的目标基因。为确定上述目标基因的mRNA表达水平改变是否最终导致相应蛋白的表达水平变化,采用Western-blot检测了上述目标基因的蛋白表达水平。检测结果表明,黄酮化合物和黄酮醇化合物通过增加p21waf1的蛋白表达并抑制cyclin B1的蛋白表达,诱导KYSE-510细胞发生G2/M周期停滞;通过增加GADD45B和14-3-3s的蛋白表达并抑制cyclin B1的蛋白表达,诱导OE33细胞发生G2/M周期停滞。同时,黄酮化合物和黄酮醇化合物通过增加PIG3的蛋白表达,提高活体caspase-9和caspase-3的蛋白水平,诱导KYSE-510和OE33细胞发生非p53依赖的线粒体介导的细胞凋亡。Western-blot进一步分析表明,黄酮和黄酮醇化合物可能通过增加p63和p73蛋白翻译或蛋白稳定性,调控p21waf1、GADD45β、14-3-3s、cyclin B1和PIG3等基因的表达。