小麦与山羊草原生质体融合及外源物质对小麦的影响

论文摘要

小麦（Triticum aestivu）是一种重要的粮食作物。为了适应多种非生物和生物胁迫对小麦产量的影响,多种多样的新品种应运而生。增加小麦的遗传变异的方法之一是体细胞杂交。它可以从其他的种或属引入新的特性。山羊草是小麦远缘族植物,它有一些可能对小麦有益的性状,特别是在抗病方面引起注意的农艺学特性。由于属间是杂交不相容的,获得这些属间杂种的唯一途径是原生质体融合和细胞杂交。本试验以小麦幼胚和山羊草的叶片为研究材料,选用了三种染料：用中性红,FDA和罗丹明B分别对其酶解出的原生质体进行染色,并分别观察1×106、5×106、1×107、5×107个/mL四个密度下原生质体染色后的融合率,最终确定最佳的处理组合。应用正交试验设计法研究了不同种类及浓度的渗透调节物质的PEG融合方法诱导属间原生质体的融合,测定不同水平的融合率,以得到最佳融合条件组合。结果表明：FDA染色小麦的胚,罗丹明B染色山羊草的叶片,最适酶解时间为4 h,最融合适密度为1×1 07个/mL。最佳融合液为：PEG6000体积分数（w/v）为25%,0.50 M的蔗糖,pH值为5.8。最佳洗液为5.5 mM CaCl2。5-氮杂胞苷（5-azaC）是一种DNA甲基化抑制剂,已广泛用于DNA去甲基化引起的植物表观遗传研究中,一些与甲基化水平低的相关稳定遗传的有益表观性状有其潜在的育种价值。CPPU是细胞分裂素类的一种非常重要的植物生长调节物质,具有促进细胞分裂、细胞扩大、延缓植物衰老等作用。目前CPPU已广泛应用于果树、瓜类蔬菜生产,但在小麦生产上应用的研究较少。为了探讨5-azaC和CPPU对不同时期小麦的影响,通过种子处理和叶面喷施的方式,并利用高效液相色谱等多种分析手段,全面研究了不同处理对衰老指标、小麦产量的影响,并从DNA甲基化的角度,进一步对5-azaC和CPPU提高小麦产量的机理作出了研究,主要研究结果如下：小麦种子经低浓度（5-500μM）5-azaC处理后,降低了DNA甲基化水平,均能诱导paksaylabgg、Taichung29和Taichung29*6/CarstensV三种小麦开花。1000μM的5-azaC处理使小麦幼苗在20 d后死亡。在开花期叶面喷施5-azaC后,能延缓衰老,使旗叶的DNA甲基化水平降低,提高了茎叶对籽粒的贡献率,使小麦籽粒中的蛋白质含量和面筋含量略有增加。CPPU可延缓旗叶的衰老,使旗叶的DNA甲基化水平降低,增加了单茎穗重,促进了有机物质向库的转运,使小麦籽粒中的蛋白质含量和面筋含量增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 原生质体融合的研究进展
• 1.1 材料的选择与预处理
• 1.1.1 材料的选择
• 1.1.2 材料的预处理
• 1.2 原生质体的游离
• 1.2.1 机械法
• 1.2.2 酶解法
• 1.3 原生质体的纯化与活力检测
• 1.4 原生质体融合的应用
• 2 外源物质对植物的影响
• 2.1 5-氮杂胞苷对植物影响的研究进展
• 2.2 CPPU对植物影响的研究进展
• 3 DNA甲基化的研究进展
• 3.1 DNA甲基化的特点
• 3.1.1 DNA甲基化
• 3.1.2 DNA去甲基化
• 3.2 DNA甲基化的生物学意义
• 3.2.1 DNA甲基化与植物的春化作用
• 3.2.2 DNA甲基化与内源基因的表达
• 3.2.3 DNA甲基化与转基因植物的基因沉默
• 3.2.4 DNA甲基化与植物的防御作用
• 3.2.5 DNA甲基化与种子萌发
• 3.3 DNA甲基化的研究方法
• 3.3.1 HPLC法
• 3.3.2 亚硫酸盐测序法
• 3.3.3 甲基化敏感的限制性内切酶方法
• 第一章 小麦与山羊草原生质体融合
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 材料制备
• 1.2.2 酶液配制
• 1.2.3 酶解
• 1.2.4 不同原生质体密度的制备
• 1.2.5 原生质体染色
• 1.2.6 原生质体融合
• 2 结果与分析
• 2.1 酶解时间对原生质体解离效果的影响
• 2.2 染色对原生质体融合观察的影响
• 2.3 原生质体的密度对异核融合率的影响
• 2.4 原生质体融合的观察
• 2.5 原生质体融合的影响因素及最佳条件
• 2.5.1 不同体积分数的PEG6000对原生质体融合的影响
• 2.5.2 渗透调节物质对原生质体融合的影响
• 2.5.3 渗透调节物质含量（M）对原生质体融合的影响
• 2.5.4 pH值对原生质体融合的影响
• 2.5.5 洗液中氯化钙含量对原生质体融合的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 外源物质对小麦的影响
• 1 材料方法
• 1.1 5-azaC对小麦苗期的影响
• 1.1.1 材料培养与处理
• 1.1.2 农艺性状观察
• 1.1.3 小麦组织蛋白提取及SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳分析
• 1.1.4 DNA提取及甲基化水平分析
• 1.2 5-azaC对小麦成熟期的影响
• 1.2.1 试验设计及处理
• 1.2.2 生理指标的测定
• 1.2.3 小麦农艺性状的测定
• 1.2.4 DNA提取及甲基化水平分析
• 1.2.5 茎叶干物质测定
• 1.2.6 小麦籽粒品质的测定
• 1.3 CPPU对小麦成熟期的影响
• 1.3.1 试验设计及处理
• 1.3.2 生理指标的测定
• 1.3.3 小麦农艺性状的测定
• 1.3.4 DNA提取及甲基化水平分析
• 1.3.5 茎叶干物质测定
• 1.3.6 小麦籽粒品质的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 5-azaC对小麦苗期的影响
• 2.1.1 5-azaC处理对小麦发芽指数的影响
• 2.1.2 5-azaC对小麦幼苗分根数的影响
• 2.1.3 5-azaC对小麦幼苗长度的影响
• 2.1.4 5-azaC对小麦幼苗重量的影响
• 2.1.5 5-azaC对小麦蛋白SDS-PAGE电泳的影响
• 2.1.6 胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶标准曲线的制作
• 2.1.7 5-azaC对小麦DNA甲基化水平的影响
• 2.2 5-azaC对小麦成熟期的影响
• 2.2.1 5-azaC对小麦成熟期旗叶中叶绿素含量的影响
• 2.2.2 5-azaC对小麦成熟期旗叶中可溶性蛋白含量的影响
• 2.2.3 5-azaC对小麦成熟期旗叶中可溶性糖含量的影响
• 2.2.4 5-azaC对小麦成熟期旗叶中丙二醛（MDA）含量的影响
• 2.2.5 5-azaC对旗叶中过氧化物酶（POD）活性的影响
• 2.2.6 5-azaC对小麦农艺性状及产量的影响
• 2.2.7 5-azaC对小麦干物质转运的影响
• 2.2.8 5-azaC对小麦旗叶DNA甲基化水平的影响
• 2.2.9 5-azaC对小麦籽粒品质的影响
• 2.3 CPPU对小麦成熟期的影响
• 2.3.1 CPPU对小麦叶绿素含量的影响
• 2.3.2 CPPU对旗叶中可溶性蛋白含量的影响
• 2.3.3 CPPU对旗叶中可溶性糖含量的影响
• 2.3.4 CPPU对旗叶中丙二醛（MDA）含量的影响
• 2.3.5 CPPU对旗叶中过氧化物酶（POD）活性的影响
• 2.3.6 CPPU对小麦农艺性状及产量的影响
• 2.3.7 CPPU对小麦干物质转运的影响
• 2.3.8 CPPU对小麦旗叶DNA甲基化的影响
• 2.3.9 CPPU对小麦品质的影响
• 3 讨论
• 3.1 5-azaC对小麦苗期的影响
• 3.2 5-azaC对小麦成熟期的影响
• 3.3 CPPU对小麦成熟期的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢
• 附录