传染性法氏囊病毒VP3基因的原核表达及鉴别诊断方法的建立

论文摘要

利用PCR （Polymerase Chain Reaction）技术扩增出IBDV的结构蛋白基因VP3,将其克隆到表达载体pPROEX-HTa 中,获得重组质粒命名为VP3/PA,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。SDS-PAGE 检测表明,经重组质粒VP3/PA 转化、诱导的受体菌E.coli DH5α能表达结构蛋白基因VP3,大小约33 kDa,表达量达到了菌体总蛋白的33.9%,经Western blot 等检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV 阳性血清发生特异性反应。利用大肠杆菌表达系统表达的VP3 重组蛋白,建立了间接ELISA 鉴别诊断方法,确定其最适抗原包被量为2ug/ml;封闭夜选用含0.5%的马血清的PBST（pH7.4,0.01mol/L）;被检血清稀释度选择1:100,作用时间为60 分钟。对92 份SPF 标准阴性血清的检测结果,经统计学分析,确定间接ELISA 判定标准为:被检血清S/P 值≥0.24 判定为阳性,S/P 值≤0.17 判定为阴性。交叉试验证实,该间接ELISA 方法对鸡其他7 种疫病阳性血清及SPF鸡血清均无交叉反应;批间、批内重复性试验表明该方法重复性良好;动物实验验证了该方法有较强的敏感性,与AGP 的符合率达到96%。实验室感染IBDV 野毒的鸡血清,以及弱毒苗、灭活苗免疫的鸡血清,间接ELISA 检测均为阳性;VP2 亚单位疫苗免疫的鸡血清均为阴性,证实此间接ELISA 可以有效的鉴别亚单位疫苗免疫鸡群和野毒感染、弱毒苗、灭活苗免疫的鸡群。该方法特异性好、敏感性高、重复性好。此间别诊断方法的建立将为最终扑灭鸡传染性法氏囊病计划提供技术支撑。

论文目录

• 绪论
• 引言
• 1 国内外研究现状
• 2 研究背景、基础和意义
• 3 拟解决的关键问题和研究内容
• 文献综述
• 1 鸡传染性法氏囊病与鸡传染性法氏囊病毒
• 2 IBDV 基因组结构及病毒蛋白功能
• 3 病毒抗原漂移机制
• 4 毒力变异机制
• 5 IBDV 疫苗的研究进展
• 6 IBD 诊断方法的研究进展
• 研究报告
• 试验一 传染性法氏囊病毒结构基因VP3 的克隆表达
• 1 试验材料
• 1.1 病毒、菌株、细胞、载体
• 1.2 主要分子生物学试剂和试剂盒
• 1.3 其它材料
• 1.4 主要仪器
• 1.5 引物的设计与合成
• 1.6 VP3 模拟抗原表位
• 1.7 技术路线
• 2 方法
• 2.1 质粒PA 的构建
• 2.2 表达载体的构建
• 2.3 诱导表达
• 2.4 表达产物SDS-PAGE 电泳
• 2.5 免疫活性检测
• 3 结果
• 3.1 目的片段的PCR 结果
• 3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3 表达产物SDS-PAGE 电泳
• 3.4 Western blot 分析
• 3.5 重组质粒的序列及所编码的蛋白分析
• 4 讨论
• 试验二 鉴别诊断方法的建立
• 1 材料
• 1.1 试验用血清及动物
• 1.2 试验用试剂及溶液
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 VP3 重组蛋白抗原的制备
• 2.2 抗原浓度和血清稀释度的确定
• 2.3 封闭剂和封闭时间的选择
• 2.4 酶标二抗不同作用时间试验
• 2.5 一抗最佳作用时间和底物显色时间
• 2.6 间接ELISA 操作步骤
• 2.7 特异性试验
• 2.8 重复性试验
• 2.9 敏感性试验
• 2.10 快诊板及试剂的保存期试验
• 3 结果
• 3.1 VP3 重组蛋白抗原
• 3.2 最适抗原包被浓度和最适血清稀释度的确定
• 3.3 最适封闭液和封闭时间的确定
• 3.4 酶标抗体最适作用时间的确定
• 3.5 一抗最佳作用时间和底物显色时间的确定
• 3.6 间接ELISA 判定标准的确定
• 3.7 特异性试验结果
• 3.8 重复性试验结果
• 3.9 敏感性试验
• 3.10 快诊板的保存期试验
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历