人肺癌单链抗体库的构建、筛选及其抗体结构与功能的研究

论文摘要

肺癌居癌症致死之首,非小细胞肺癌患者约占肺癌患者总数的80%。绝大多数非小细胞肺癌患者处于不可动手术阶段。目前治疗非小细胞肺癌的策略有化疗、手术治疗和放疗,但大多数患者易复发从而导致死亡。随着肿瘤细胞生物学的研究深入,出现了分子靶向治疗模式。在非小细胞肺癌细胞中发现了血管内皮生长因子受体2表达量的变化,血管内皮生长因子受体2及其配体的过度表达是肺癌一个重要特征。因此,血管内皮生长因子受体2成为一个非常有吸引力的治疗靶点。随着抗血管生成药物的发展,时至今日,大量的研究工作聚集于开发抗血管内皮生长因子受体抗体,特别是人源单链抗体的研制。 目前有几种展示系统可以用于生产人源抗体,例如噬菌体展示、细胞表面展示、核糖体展示和mRNA展示。这些方法的主要原理是在筛选过程中将基因型和表型连接起来。体内法主要受以下一种或几种因素而影响筛选效率:①不能在不同的细胞环境下进行筛选;②不能对对细胞有毒性的蛋白进行筛选;③细胞循环筛选压力;④较低的转化效率。而核糖体展示完全在体外进行筛选,它克服了上述不利因素。通过在体外翻译系统（Escherichia coli S30或rabbit reticulocyte）中形成抗体-核糖体-mRNA复合物（ARM）,各抗体将与它们相应的mRNA,利用抗体结合反应的功能特性进行筛选,筛选到的mRNA可以通过RT-PCR进行扩增与回收或下一轮筛选、突变和克隆步骤。本研究的目的是构建肺癌人源单链抗体库并运用核糖体展示技术对其进行筛选,获得的主要研究结果如下: 我们从30名肺癌患者志愿者抽取血样,进行淋巴细胞的分离和总RNA的提取,通过PCR技术扩增人全套重链可变区基因和轻链可变区基因,并对它们进行拼接,连接肽为GSASAPTLFPLVS。全长单链抗体基因包括一个T7启动子和一个翻译起始序列（Kozak序列）。所构建的人源单链抗体库的库容量为7.6×1013,经DNA fingerprinting和测序分析33个阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。我们选取人血管内皮生长因子受体2作为目标抗原对该单链抗体库进行核糖体展示筛选研究。经过三轮筛选,我们成功地获得了anti-VEGFR-2单链抗体基因。随后经双酶切技术将anti-VEGFR-2单链抗体基因连入表达载体（pET-30（a）+）并转化E. coli BL21进行表达。在LB培养基中37℃培养12小时,经IPTG诱导表达6小时,收获菌体,经SDS-PAGE分析,Anti-VEGFR-2单链抗体的分子质量为31kDa,表达量占总体蛋白的27%。经亲和层析法纯化的Anti-VEGFR-2单链抗体的亲和常数为1.3×109L/mol,抗体效价为1:3200。Anti-VEGFR-2单链抗体序列经软件DNA-PLOT分析后发现该抗体的重链可变区属于VH3亚群,轻链可变区属于VκⅢ

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要英文缩写词
• 第一篇 文献综述部分
• 第一章 抗体的结构与功能
• 1 抗体的分子结构
• 1.1 抗体分子的基本结构
• 1.2 抗体分子的功能区结构
• 1.3 免疫球蛋白超家族
• 1.4 免疫球蛋白的不均一性
• 2 抗体分子的基因结构和重排
• 2.1 抗体基因的基本结构
• 2.2 可变区基因的重组及其机制
• 2.3 抗体多样性的来源
• 3 抗体的生物学功能
• 3.1 特异性结合相应抗原
• 3.2 效应功能
• 3.3 通过胎盘
• 第二章 抗体库技术研究进展
• 1 噬菌体抗体库技术
• 1.1 噬菌体展示技术系统
• 1.2 噬菌体抗体技术的操作方法
• 1.3 噬菌体展示技术的特点与优势
• 2 核糖体展示抗体库
• 2.1 核糖体展示技术的发展
• 2.2 核糖体展示技术的原理
• 第三章 血管内皮生长因子受体-2及其信号转导作用的研究进展
• 1 KDR在血管生成中起主导作用
• 2 KDR介导肿瘤血管生成
• 3 KDR信号转导与血管生成及维持
• 3.1 KDR信号转导与内皮细胞存活
• 3.2 KDR信号转导与内皮细胞增殖
• 3.3 KDR信号转导与内皮细胞迁移
• 3.4 KDR信号转导与内皮细胞渗透性改变
• 4 以KDR及其通路为靶点的抗肿瘤治疗
• 5 结语
• 参考文献
• 第二篇 试验部分
• 第一章 概述
• 第二章 肺癌患者外周血淋巴细胞的分离与CDNA的合成
• 1 试验策略
• 2 试验材料与设备
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设备
• 3 试验方法
• 3.1 从人外周血分离淋巴细胞
• 3.1 总细胞RNA的提取
• 3.3 RNA甲醛变性电泳
• 3.4 cDNA的合成
• 4 试验结果与讨论
• 4.1 测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量
• 4.2 血样和RNA的质量控制
• 参考文献
• 第三章 肺癌人源单链抗体库的构建及库质量的评定
• 1 构建策略
• 2 试验材料与设备
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试验设备
• 3 试验方法
• 3.1 PCR克隆抗体基因片段
• H-linker的PCR扩增'>3.2 V_H-linker的PCR扩增
• 3.3 Vκ的PCR扩增
• 3.4 Vλ的PCR扩增
• 3.5 Cκ的PCR扩增
• 3.6 单链抗体（scFv）基因的拼接
• 3.7 从琼脂糖胶中回收DNA片段
• 3.8 连接反应
• 3.9 用氯化钙法制备感受态细胞
• 3.10 转化
• 3.11 质粒提取操作步骤
• 3.12 测序与序列分析
• 3.13 用DNA fingerprinting技术对单链抗体库多样性进行分析
• 3.14 单链抗体库库容量的计算方法
• 4 试验结果与讨论
• 4.1 关于引物
• H-linker、Vκ、Vλ和Cκ的PCR扩增结果'>4.2 V_H-linker、Vκ、Vλ和Cκ的PCR扩增结果
• H-linker基函与Vκ基因的拼接和V_H-linker基因与Vλ基因、Cκ基因的拼接'>4.3 V_H-linker基函与Vκ基因的拼接和V_H-linker基因与Vλ基因、Cκ基因的拼接
• 4.4 DNA fingerprinting技术对单链抗体库多样性进行分析及库容量的计算
• 4.5 序列分析
• 5 小结
• 参考文献
• 第四章 运用核糖体展示技术对肺癌人源单链抗体库的筛选研究
• 1 筛选策略
• 2 试验材料与设备
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设备
• 3 试验方法
• 3.1 抗原-磁珠的制备
• 3.2 运用核糖体展示系统对单链抗体库进行筛选
• 3.3 连接反应
• 3.4 感受态细胞的制备
• 3.5 转化
• 3.6 质粒提取
• 3.7 测序和序列分析
• 3.8 所有试验所需要分子生物学溶液的配制
• 4 试验结果与讨论
• 4.1 体外无细胞翻译系统
• 4.2 镁离子浓度和温度
• 4.3 筛选效果
• 4.3 序列分析
• 5 小结
• 参考文献
• 第五章 抗VEGFR-2单链抗体的克隆、表达及其功能分析
• 1 试验材料与设备
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验设备
• 2 试验方法
• 2.1 Anti-VEGFR-2 scFv基因的扩增
• 2.2 连接反应、转化反应、阳性重组子的筛选和重组质粒的提取
• 2.3 重组质粒的酶切
• 2.4 表达载体的酶切
• 2.5 连接
• 2.6 感受态细胞的制备与转化
• 2.7 阳性质粒的筛选
• 2.8 SDS-PAGE凝胶电泳
• 2.9 目的蛋白表达量的测定
• 2.10 表达产物的分离、纯化和复性
• 2.11 纯化Anti-VEGFR-2单链抗体的含量测定
• 2.12 抗体效价测定
• 2.13 抗体亲和力的测定
• 2.14 抗体亲和力测定结果计算
• 3 试验结果与讨论
• 3.1 Anti-VEGFR-2单链抗体在大肠杆菌BL21中的诱导表达
• 3.2 Anti-VEGFR-2单链抗体效价和抗体亲和力的检测
• 4 小结
• 参考文献
• 第六章 抗VEGFR-2单链抗体的同源模建
• 1 方法
• 1.1 预测工具
• 1.2 结果显示
• 1.3 分析过程
• 2 结果与讨论
• 3 小结
• 参考文献
• 第七章 原子力显微镜对抗VEGFR-2单链抗体与抗原VEGFR-2相互作用的表征
• 1 AFM简介
• 1.1 AFM特点
• 1.2 AFM原理
• 1.3 AFM扫描技术要求
• 2 材料与设备
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设备
• 3 试验方法
• 3.1 云母片的前处理
• 3.2 单链抗体溶液的吸收
• 3.3 单链抗体-抗原免疫复合物的观察
• 3.4 原子力显微镜观察
• 4 结果与讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 总结、创新点及后续研究展望
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 攻读博士学位期间发表及待发表的论文
• 致谢