论文摘要
背景：瘢痕疙瘩被认为是一种皮肤良性肿瘤,具有向周围正常组织浸润生长的特性,并伴有难以忍受的痒痛,严重影响患者的生活质量。长期存在的瘢痕疙瘩内可出现组织的坏死,反复感染,最终导致瘢痕癌。至今为止,尚缺乏行之有效的治疗手段。因此,对瘢痕疙瘩治疗的研究有很高的临床意义。本课题根据瘢痕疙瘩的生物学特性与恶性肿瘤类似的特点,以及瘢痕疙瘩组织中乏氧诱导因子高表达的事实,借鉴肿瘤学对乏氧诱导因子作用的研究成果,在我们前期工作成果的基础上,进一步对放疗和/或槲皮素作用后的瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学改变进行分子水平的检测,明确槲皮素和/或放疗干预后对瘢痕疙瘩成纤维细胞乏氧诱导因子HIF-1α表达的影响。目的：1.比较常氧和乏氧条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长曲线；2.比较瘢痕疙瘩与正常皮肤组织来源的成纤维细胞对放疗的敏感程度,并明确西者敏感度区别最大的最佳放疗剂量；3.明确体外培养的瘢痕疙瘩来源成纤维细胞的HIF-1α的表达情况和新鲜瘢痕疙瘩组织切块中HIF-1α的表达情况；4.观察槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞的促凋亡作用及其与剂量之间的关系；5.探讨槲皮素、放疗干预与HIF-1α表达之间的关系；6.明确槲皮素是否具有放疗增敏作用。方法：1.第一部分：细胞复苏培养传代后利用3-6代细胞用作实验。使用1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气混合气体作为培养细胞供应气体,构建乏氧模型。将细胞分为常氧组和乏氧组,分别接种于96孔板,每板为1000个细胞组、3000个细胞组、5000个细胞组,各5复孔。每隔24小时应用CCK-8试剂盒检测吸光度值,明确细胞增殖情况。2.第二部分：常规方法培养正常皮肤组织成纤维细胞（Norm组）和瘢痕疙瘩来源成纤维细胞（Kld组）,按放疗剂量不同分为15Gray、20Gray、25Gray组,观察时间点为放疗后24小时以及48小时,取各组细胞,应用细胞凋亡检测试剂盒（FITC Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit）进行流式检测。3.第三部分：将细胞分为正常皮肤组织成纤维细胞组（Norm）和瘢痕疙瘩来源成纤维细胞组（Kld）,加或不加20gray放疗剂量,应用Westernblot和免疫荧光方法来检测HIF-1α的表达水平；且应用免疫组化的方法来实体验证新鲜活体瘢痕疙瘩组织块中的HIF-1α的表达、分布情况。4.第四部分：本组实验中成纤维细胞均为乏氧培养,且按放疗与不放疗分为两大组,分别应用Opmol/L、20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L浓度的槲皮素进行干预,通过流式检测其细胞凋亡水平,明确最佳槲皮素剂量。细胞分为Norm组和Kld组,每组均分别采用或不采用20Gray剂量照射处理,继续培养24小时后,用Western blot方法检测各组HIF-1α的蛋白表达情况。在Kld组中,使用或不使用40μmol/L槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞进行干预,应用Western blot、Real time-PCR和免疫荧光检测Kld组成纤维细胞HIF-1α蛋白和基因表达情况。结果：1.第一部分：当检测细胞密度为1000个、3000个、5000个细胞/1001μ1时,乏氧组瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖速度较常氧组快,在培养后5天,乏氧组细胞中甲臜产物的OD值明显高于常氧组（P<0.05）。2.第二部分：放疗后24小时,不同放疗剂量下,Kld组细胞凋亡比例较Norm组普遍降低（P<0.05）。在20Gray的放疗剂量下,Norm组（12.5±0.4%）和Kld组（6.3士0.1%）细胞凋亡比例差异最大（P=0.000）。放疗后48小时,不同放射剂量下,Kld组细胞凋亡程度较Norm组仍然较轻,与放疗后24小时相比,两组细胞凋亡比例均不同程度降低。3.第三部分：与Norm组相比,Kld组HIF-1α的蛋白表达含量增加近10倍,其中,经20Gray放疗的Kld组HIF-1α的蛋白表达量较非放疗Kld组增加20%。免疫荧光检测Norm组在放疗和非放疗干预情况下均未能检测到HIF-1α的表达；而Kld组中均可检测到；放疗组中HIF-1α的表达强度比非放疗组强。HIF-1α特异性免疫组化处理结果显示HIF-1α广泛分布在表皮基底层、少量棘层细胞和真皮成纤维细胞中,主要环绕细胞核存在于细胞质。4.第四部分：放疗组和非放疗组的瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡比率与槲皮素呈剂量性增加,在40μmol/L槲皮素作用下,放疗与非放疗组间差异最明显；Westemblot结果显示放疗后Kld组细胞中HIF-1α的表达量高于非放疗组水平；在Kld组细胞中,加入40μmol/L槲皮素干预后,HIF-1α的表达量明显下降。Realtime-PCR结果显示经放疗和槲皮素干预后,瘢痕疙瘩成纤维细胞中的HIF-1α基因表达量较未经处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞降低近50倍；免疫荧光结果显示加入40μmol/L槲皮素干预后的瘢痕疙瘩成纤维细胞,放疗和非放疗组中HIF-1α的表达量较未经槲皮素干预组低。结论：1.体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞在乏氧环境中增殖速率明显高于正常培养环境对照组。2.体外培瘢痕疙瘩成纤维细胞对放射治疗具有抵抗作用,主要体现于细胞凋亡水平的下降。3.体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞较正常皮肤组织成纤维细胞高表达HIF-1α,且放疗干预可增加HIF-1α的表达；新鲜瘢痕疙瘩组织切块中HIF-1α也呈高表达状态。4.槲皮素能够促进体外瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡,并呈剂量依赖关系。5.乏氧条件下,槲皮素干预可明显降低瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF-1α的表达水平。6.槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞的放疗抵抗具有增敏作用。
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