无核荔枝胚败育相关蛋白质的分离鉴定及cDNA克隆

论文摘要

关于荔枝胚胎发育的研究,我国学者的研究较为深入,主要集中于形态解剖学和生理生化研究水平。形态学和解剖学的研究表明,胚胎败育型荔枝在授粉后10d左右,其胚胎发育受阻,花后15d,胚珠已明显萎缩导致果实无核。荔枝胚胎发育过程中内源激素变化表明,败育胚胎中IAA、GA3、CTK等促进型激素低于正常发育胚胎,而抑制型激素ABA则高于正常胚胎。败育胚胎内源激素与正常胚胎的差异,可能造成生理代谢紊乱及物质能量的亏损而导致果实无核。目前关于荔枝胚胎发育的基因调控及蛋白质组研究较少,仅陈伟及张以顺等采用双向电泳技术进行了荔枝胚胎发育后期总蛋白质的分离,还没有进一步的蛋白质组分析及鉴定研究。张以顺等克隆到一个与荔枝胚败育相关的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因。目前尚无更多的相关研究。海南无核荔枝是荔枝中的珍稀品种,其无核率高达95%,但其无核率极易受花期温度的影响,无核率的不稳定性严重影响了该品种的推广种植和经济效益。形态学观察表明,海南无核荔枝无核果实的形成是由于授粉后低温的影响导致胚胎败育所引起。海南无核荔枝经中国热带农业科学院和华南热带农业大学国家重点实验室鉴定,认为无核荔枝是一个突变体,可能由于某些基因发生突变,使胚胎发育早期的生化过程发生紊乱或受到抑制,导致胚胎败育。目前已对海南无核荔枝进行了部分应用基础方面的研究,包括胚退化的生物学,胚内源激素动力学,与无核荔枝花、果、胚发育相关基因的克隆等,为无核荔枝的产业化提供了有力的科技支撑。蛋白质作为基因功能的体现者和执行者,与生命体的生物功能和生理活动密切相关。机体所处的不同环境和本身的生理状态差异,会导致基因转录产物有不同的剪切和转译成不同的蛋白。因而蛋白质组学已成为当今研究热点。采用蛋白质组学技术及方法获得野生型与突变体间的差异蛋白质,对于目的蛋白质的功能及其编码这些蛋白的基因的功能研究,具有重要的意义,也为进一步探讨目的蛋白质与生物功能及生理活动的关系奠定了基础。本研究从差异蛋白质组学入手,分别提取无核荔枝开花后20d和开花后40d正常发育胚和败育胚的总蛋白质,采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,得到无核荔枝

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 荔枝胚胎发育研究概况
• 1.1 荔枝胚胎发育的形态学、解剖学研究
• 1.2 荔枝胚胎发育的生理生化研究
• 1.2.1 荔枝胚胎发育与内源激素的关系
• 1.2.2 荔枝胚胎发育与多胺的关系
• 1.2.3 荔枝胚胎发育与酚类物质关系
• 1.2.4 荔枝胚胎发育与蛋白质关系
• 1.3 荔枝胚胎发育的遗传学分析
• 1.4 荔枝胚胎发育的基因调控
• 2 植物胚胎发育的基因调控
• 2.1 极性建立的基因调控
• 2.2 形态建成的基因调控
• 2.3 器官形成与成熟期的基因调控
• 3 蛋白质组学研究进展
• 3.1 蛋白质组学研究任务和策略
• 3.2 蛋白质组研究技术
• 3.2.1 双向凝胶电泳（2-DE）
• 3.2.2 蛋白质组技术的支柱-鉴定技术（Identification）
• 3.2.3 蛋白质组研究的新技术
• 3.3 生物信息学网
• 3.4 植物蛋白质组学研究进展
• 3.4.1 植物群体遗传蛋白质组学
• 3.4.2 植物环境信号应答和适应机制蛋白质组学
• 3.4.3 植物激素蛋白质组学研究
• 3.4.4 植物组织器官蛋白质组学
• 3.4.5 植物亚细胞蛋白质组学
• 4 本研究的目的意义
• 5 实验方案设计和技术路线
• 第二章 无核荔枝胚发育早期蛋白质提取与分离
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 所用试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 蛋白质提取
• 1.2.2 蛋白质浓度测定
• 1.2.3 固相pH 梯度IEF-SDS 双向凝胶电泳
• 1.2.4 凝胶扫描
• 1.2.5 计算机图像分析
• 2 结果与分析
• 2.1 花后20d 正常发育胚与败育胚2-DE 图谱特征
• 2.2 花后20d 正常发育胚与败育胚2-DE 图谱分析
• 3 讨论
• 第三章 无核荔枝胚发育后期蛋白质提取与分离
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 所用试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 蛋白质提取
• 1.2.2 蛋白质浓度测定
• 1.2.3 固相pH 梯度IEF-SDS 双向凝胶电泳
• 1.2.4 凝胶扫描
• 1.2.5 计算机图象分析
• 2 结果分析
• 2.1 花后40d 正常发育胚与败育胚2-DE 图谱特征
• 2.2 花后40d 正常发育胚与败育胚2-DE 图谱分析
• 3 讨论
• 第四章 差异蛋白质的MALDI-TOF-MASS 鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 所用试剂
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 花后40d 胚胎差异蛋白的肽质量指纹图谱
• 2.2 MALDI-TOF 质谱鉴定结果在蛋白质数据库中的检索
• 3 讨论
• 3.1 影响鉴定结果的关键因素
• 3.2 所鉴定蛋白在胚发育过程中的功能研究及推测
• 3.3 从蛋白质途径分离、克隆基因的可行性
• 第五章 无核荔枝胚发育相关基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 无核荔枝胚胎总RNA 提取
• 1.2.2 RT-PCR 引物设计与合成
• 1.2.3 cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 cDNA 的PCR 扩增
• 1.2.5 产物片段的纯化与回收
• 1.2.6 PCR 回收产物的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 有核胚及无核胚总RNA 的提取结果
• 2.2 RT-PCR 及其回收
• 2.3 克隆片段的核苷酸序列
• 2.3.1 克隆ATPase 核苷酸片段序列
• 2.3.2 克隆Actin 核苷酸片段序列
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢