西尼罗病毒套式RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法的建立

论文摘要

西尼罗病毒（WNV）是一种虫媒病毒，属于黄病毒科，黄病毒属。在自然界中，西尼罗病毒在鸟和蚊子（主要是库蚊）之间形成循环链，主要感染人和马。西尼罗病毒主要分布在非洲、中东、亚洲中西部、印度和欧洲。1999年8月西尼罗病毒首次在西半球登陆，美国纽约发生人和马感染西尼罗脑炎，此后西尼罗病毒迅速传遍整个美国，并有向外传播的趋势。目前，没有有效的治疗措施，因此，建立有效的检测方法来预防西尼罗病毒侵入是非常重要的。1．西尼罗病毒套式RT-PCR检测方法的建立从GenBank上调取西尼罗病毒的基因序列，经过分析，设计并合成两套套式RT-PCR引物，分别对西尼罗病毒灭活苗进行扩增，结果能扩增出与目的片断大小一致的条带，建立了套式RT-PCR检测方法，经反应条件优化后，对乙型脑炎病毒（JEV）、黄热病毒（YFV）等11种相关病毒核酸进行扩增，发现具有良好的特异性；能分别扩增出85个拷贝和62个拷贝的双链DNA，显示建立的套式RT-PCR检测方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点，可用于口岸WNV的检测和监测。2．西尼罗病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立从GenBank上调取西尼罗病毒的基因序列，针对其基因保守区域的核苷酸序列，用DNAStar和Primer Expression 3.0软件设计3对引物和TaqMan探针，以西尼罗病毒的cDNA为模板，建立了WNYA、WNYB和WNYC三套实时荧光RT-PCR检测方法，经反应条件优化后，对JEV、YFV等11种病毒核酸进行扩增，发现具有良好的特异性；对10倍倍比稀释的双链DNA、质粒DNA、cDNA和RNA进行扩增检测其灵敏度，发现建立的WNYA和WNYC荧光能分别扩增出30个拷贝和65个拷贝的双链DNA以及420个拷贝和460个拷贝的质粒DNA，WNYB对cDNA的扩增效率明显低于WNYA和WNYC，证明建立的WNYA和WNYC实时荧光RT-PCR检测方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点，可用于WNV样品的检测。3．西尼罗病毒基因片断的克隆本研究以常规RT-PCR技术扩增套式和荧光PCR检测方法所需的目的片断，将其插入到pMD18-T Vector中进行克隆，获得的阳性克隆分别为pMD18-T-A、pMD18-T-B、pMD18-T-YA和pMD18-T-YC。测序结果与GenBank已发表的序列进行比较证实为WNV序列，表明建立的PCR方法是特异性的，获得的克隆质粒可作为建立的PCR方法的阳性对照。4．西尼罗病毒检测试剂盒的组装将建立的西尼罗病毒套式RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法组装成两个试剂盒，进行性能检测后，证明试剂盒可以对WNV进行快速的检测。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一篇 文献综述
• 第一章 西尼罗病毒的研究进展
• 1. 病原学
• 2. 流行病学
• 3. 临床表现和病理变化
• 4. 检测技术研究进展
• 5. 西尼罗病毒的风险评估、口岸监测及预防控制
• 6. 西尼罗病毒病的治疗及疫苗研究进展
• 7. 结束语
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第二章 西尼罗病毒套式 RT-PCR检测方法的建立
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第三章 西尼罗病毒实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第四章 西尼罗病毒基因片断的克隆
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第五章 西尼罗病毒 RT-PCR检测试剂盒的配制
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 英文摘要
• 结论
• 附录（攻读硕士期间发表的文章）
• 致谢