丙戊酸钠对Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用及机制探讨

论文摘要

目的：t（8;21）/AML的发生机制与染色体易位产生的特异性融合蛋白AML1-ETO异常募集组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）,进而干扰AML1所激活靶基因的正常转录相关。本实验研究HDAC抑制剂丙戊酸钠（VPA）体内给药对白血病细胞系Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤生长的影响,探讨可能的作用机制。方法：建立Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤模型,分为对照组和VPA治疗组进行实验,观察并记录各组裸鼠移植瘤的生长情况,计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率。HE染色观测肿瘤细胞形态。末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP原位缺口末端标记（‘TUNEL）检测肿瘤细胞凋亡。RT-PCR和Western blot方法分析粒-单核细胞刺激因子（GM-CSF）、组蛋白脱乙酰化酶1（HDAC1）、乙酰化组蛋白H3（Ac-H3）、Survivin的mRNA或蛋白的表达。染色质免疫共沉淀（ChIP）法检测VPA对GM-CSF基因启动子区域组蛋白H3乙酰化程度的影响。结果：1. Kasumi-1细胞的裸鼠移植瘤模型特点裸鼠前肢跟部皮下接种生长状态良好的Kasumi-1细胞后,第3天开始成瘤,成瘤率为100%。荷瘤裸鼠随着时间延长,肿瘤体积逐渐增大,绘制肿瘤生长曲线。经病理切片检查,裸鼠的外周血、肝脏、肺脏均未见瘤细胞转移。RT-PCR方法检测Kasumi-1细胞标志性融合基因AML1/ETO,证实其表达存在。2.VPA对裸鼠移植瘤生长的抑制作用VPA体内用药明显抑制裸鼠Kasumi-1细胞移植瘤的生长,观测到随着用药时间延长,VPA用药组移植瘤生长速度相比对照组明显减慢,用药12天后处死小鼠,实验过程中没有裸鼠死亡,VPA组瘤体积及重量与对照组相比明显减少,具有统计学差异（P<0.05）,计算肿瘤抑制率（IR%）为57.25%。3.VPA对裸鼠移植瘤肿瘤细胞形态学的影响HE染色光镜观察显示,对照组移植瘤细胞基本均一呈圆形,有明显核仁；VPA治疗组细胞异形性明显,大小不一,核浆比缩小,部分核仁消失,核碎裂或核固缩的细胞增多的分化和凋亡的表现。4.VPA对裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡的影响应用TUNEL方法检测细胞凋亡,计算凋亡细胞指数（AI%）,结果显示两组均可见凋亡细胞,凋亡指数分别为对照组（0.26±0.11）%；VPA组（3.66±0.76）%。两组具有统计学差异（P<0.05）。5.VPA对移植瘤Survivin mRNA表达水平的影响经半定量RT-PCR的方法检测移植瘤Survivin mRNA表达的变化,VPA组和对照组Survivin mRNA相对表达水平分别为（0.75±0.003）和（1.11±0.322）,VPA组明显减少,具有统计学差异（P<0.01）。6.VPA对裸鼠移植瘤GM-CSF mRNA及蛋白表达水平的影响经半定量RT-PCR分析裸鼠移植瘤组织GM-CSF mRNA表达的变化,VPA组和对照组GM-CSF mRNA相对表达水平分别为（1.08±0.188）和（0.69±0.105）,VPA组明显增加,具有统计学差异（P<0.01）。经Western-blot检测GM-CSF蛋白发现：VPA组为0.900±0.113,对照组为0.71±0.042,VPA组GM-CSF蛋白表达量增加,具有统计学差异（P<0.01）。经免疫组化检测瘤组织中GM-CSF表达发现,VPA组GM-CSF表达明显多于对照组。7.VPA对裸鼠移植瘤肿瘤组织中HDAC1蛋白表达水平的影响经Western-blot检测核蛋白HDAC1蛋白表达发现,VPA组HDAC1蛋白表达水平（0.536±0.180）较对照组（1.073±0.605）减少,具有统计学差异（P<0.01）。经免疫组化检测裸鼠移植瘤肿瘤组织中HDAC1表达发现,VPA组相对对照组,HDAC1表达明显减少。8.VPA对裸鼠移植瘤肿瘤组织Ac-H3蛋白表达水平的影响经Western-blot检测核蛋白Ac-H3表达发现,VPA组Ac-H3蛋白表达水平（1.034±0.232）较对照组（0.332±0.005）增加,具有统计学差异（P<0.01）。经免疫组化检测瘤肿瘤组织中Ac-H3表达发现,VPA组相对对照组,Ac-H3表达明显增多。9. GM-CSF启动子区域组蛋白乙酰化程度的变化经ChIP检测,结果发现相比对照组,VPA组GM-CSF启动子区域组蛋白H3的乙酰化程度明显增高。结论：VPA对Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤有明显生长抑制作用,诱导肿瘤细胞分化及凋亡,其机制与VPA作为HDAC抑制剂抑制细胞核内HDAC表达,增加GM-CSF基因启动子区域的组蛋白乙酰化程度,解除AML1-ETO对靶基因的转录抑制有关。该研究为临床上t（8;21）/AML的靶向治疗提供了动物体内实验依据。

论文目录

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