建立作用于CCR5启动子的药物筛选方法及初步应用

论文摘要

背景和目的获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的。HIV进入CD4+细胞是由于病毒衣壳糖蛋白、CD4受体与趋化因子受体相互作用完成的。初始感染的HIV-1病毒株结合的是趋化因子受体5（CC-chemokine receptor5,CCR5）,而在感染后期的HIV-1 X4毒株,则结合趋化因子受体CXCR4（CXC-chemokine receptor 4,CXCR4）。结构正常的CCR5蛋白质起到促进HIV入胞的通道蛋白的功能。因此,CCR5是HIV感染初期最重要的辅助受体。近年来,对CCR5基因多态性的研究引起许多学者的兴趣,其中CCR5△32和CCR5m303纯合子的个体能有效地抵抗HIV-1对人体的感染,CCR5基因多态性对AIDS发病的影响从侧面证明CCR5在HIV-1感染和致病过程中的重要性。越来越多的实验研究结果表明,CCR5△32个体拥有正常的免疫功能和炎症反应,并且对HIV-1的感染表现出显著的抵御能力。因此在理论上,可以通过作用于CCR5的promoter,降低CCR5基因的表达来预防和治疗HIV感染。国外已有许多关于CCR5拮抗剂的研究,有些药物已处于Ⅱ期临床研究阶段。中医药治疗具有药源丰富、价格低廉、毒副作用小以及能提高机体免疫功能等特点,那么,中药是否可以通过作用于CCR5基因的promoter来发挥抗HIV/AIDS作用?为此,本实验拟建立一种方法,筛选作用于CCR5 promoter的具有潜在抗HIV/AIDS作用的中药。先将CCR5的promoter重组到萤光素酶报告基因载体pGL3-neo的萤光素酶报告基因上游;转染并筛选得到一组稳定转染有上述重组载体的Jurkat（急性淋巴瘤细胞）细胞株;然后选取7种中药分别作用于稳定转染细胞株,通过检测报告基因萤光素酶的活性反映CCR5启动子活性,分析7种中药对CCR5基因启动子的影响,建立作用于HIV辅助受体CCR5启动子的抗HIV/AIDS药物体外筛选方法。方法设计并合成扩增CCR5启动子的引物,从人基因组DNA中PCR扩增CCR5的启动子基因序列。改建萤光素酶报告载体pGL3,设计并合成扩增抗性筛选标记neo单元的引物,从pcDNA3.1质粒中PCR扩增neo单元,将neo单元克隆入T载体（pGEM-T-neo）,酶切鉴定证实无误后,将neo插入质粒pGL3中,PCR鉴定筛选正向插入克隆;将CCR5启动子基因片段克隆入T载体（pGEM-T-CCR5）,再亚克隆入质粒pGL3-neo,双酶切、PCR和测序分析鉴定萤光素酶报告质粒:pGL3-neo-CCR5。脂质体包裹转染pGL3-neo-CCR5入Jurkat细胞（急性T淋巴细胞白血病细胞）,G418筛选得到稳定转染细胞株,扩大培养后分组。使用7种中药（双黄连、川琥宁、甘草、猪苓、桔梗、黄芪、黄芩）分别作用于各组稳定转染细胞16h后,通过检测报告基因萤光素酶活性反映中药对CCR5启动子的作用。结果数据用统计学软件SPSS13.0分析。结果1.PCR扩增CCR5启动子基因片段,电泳可见987bp处有明亮条带,与设计一致。2.PCR扩增neo单元,电泳可见1882bp处有明亮条带,与设计一致。3.将neo单元、CCR5启动子基因片段分别与pGEM-T Easy连接后,转化DH5α,筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-neo、重组子pGEM-T-CCR5。4.将neo单元插入萤光素酶报告载体pGL3,得到带有筛选标记的报告基因载体pGL3-neo。5.将CCR5启动子基因片段亚克隆入pGL3-neo,得到萤光素酶报告质粒pGL3-neo-CCR5,双酶切、PCR鉴定证明插入序列正确。DNA序列测序,结果与设计完全一致。6.G418筛选得到稳定转染pGL3-neo-CCR5细胞株。7.萤光素酶活性检测:双黄连可使被转染细胞的萤光素酶活性显著降低（P＜0.05）,川琥宁、黄芩、黄芪可使被转染细胞的萤光素酶活性显著升高（P＜0.01）。猪苓、甘草、桔梗组细胞的萤光素酶活性与不加中药对照组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1.构建出CCR5 Promoter的萤光素酶报告基因载体,G418筛选得到稳定转染上述载体的细胞株,建立起作用于CCR5 promoter的药物体外筛选方法。2.双黄连可抑制体外培养细胞中CCR5启动子的活性,具有潜在的抗HIV/AIDS作用;川琥宁、黄芩、黄芪可使体外培养细胞CCR5启动子活性增高,提示HIV感染者不宜使用这些药物和含有这些成分的药物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 建立作用于CCR5启动子的药物筛选方法及初步应用
• 前言
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 综述 CCR5的研究进展
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 致谢