益智仁中原儿茶酸对PC12细胞保护作用研究

论文摘要

益智仁是姜科（Zingiberaceae）植物益智（Alpinia oxyphylla MIQUEL）的成熟果实,自古以来就是中医临床上的常用药材,有温脾止泻,摄唾涎,固精缩尿的功效。现代研究表明,益智仁有强心、抗癌、抗过敏等药理活性,特别是近几年的研究发现了益智仁的神经保护作用,然而对于此类研究目前主要是以粗提物为实验对象,药理作用机制也不明确。 本研究选用与多巴胺能神经元有许多相似特征的PC12细胞为实验对象,以过氧化氢（H2O2）、谷氨酸（Glu）、及1-甲基4-苯基吡啶离子（MPP+）等神经毒素分别诱导细胞损伤,从而建立体外多巴胺能细胞的氧化应激模型。结果表明,以上三种毒素均可对多巴胺能的PC12细胞产生毒性作用,在一定浓度范围内其毒性作用呈剂量和时间依赖关系。在此基础上,选择H2O2 0.4mM（24h）、Glu 10mM（48h）、及MPP+1mM（48h）作为下一步实验的模型条件。 通过以上建立的损伤模型,对益智仁中的神经活性部位进行跟踪筛选。实验发现,益智仁的乙酸乙酯部位具有明显的抗氧化应激介导的保护作用;对其进一步分离纯化,最终得到一个活性单体化合物。采用光谱学技术（红外、紫外、核磁共振波谱和质谱）对得到的单体化合物进行结构解析,最后鉴定为一种酚类化合物——3,4-二羟基苯甲酸,即原儿茶酸（Protocatechuic acid,PCA）。PCA从益智仁中分离得到目前尚未见有文献报道。在0.06～1.2mM的剂量范围内,PCA对细胞具有一定的增殖作用,而且剂量依赖地保护了氧化应激所致的细胞死亡。通过比较在不同损伤模型中的半数有效剂量(IC50)发现,PCA对MPP+介导的细胞损伤具有更加明显的保护作用,这个结果提示了PCA在不同毒素中的不同作用机制。 利用H2O2造成PC12细胞的直接氧化应激损伤,探讨PCA在神经细胞中的抗氧化机制。培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的测定与MTT的结果基本一致,PCA剂量依赖地减少了细胞中LDH的漏出;通过细胞核的形态观察以及流式细胞仪的分析,PCA可以减少H2O2介导的PC12细胞凋亡性死亡;PCA抗H2O2氧化应激损伤的保护作用与细胞内GSH水平的提高及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的激活相关,虽然谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性并没有显著变化;另外,H2O2和Fe2+可以通过Fenton反应产生羟自由基（·OH）,而PCA同样显著减弱了H2O2/Fe2+所致的细胞损伤。这些结果表明了在受活性氧（ROS）介导的氧化应激损伤时,PCA可以有效的保持PC12细胞内的抗氧化防御体系处于正常的水平,从而抑制细胞的功能衰竭而死亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1.文献综述
• 1.1 氧化应激与神经退行性疾病
• 1.1.1 活性氧的产生与清除
• 1.1.2 活性氧的作用机制
• 1.1.3 氧化应激与阿尔茨海默病（AD）
• 1.1.4 氧化应激与帕金森病（PD）
• 1.2 氧化应激与细胞凋亡
• 1.2.1 细胞凋亡的一般概念
• 1.2.2 细胞凋亡主要调控因子
• 1.2.3 氧化应激与细胞凋亡
• 1.3 天然抗氧化剂在神经退行性疾病中的研究及应用
• 1.4 中药益智仁的研究概况
• 1.4.1 益智仁的生物学特性
• 1.4.2 益智仁化学成分的研究概况
• 1.4.3 益智仁药理作用的研究概况
• 1.5 小结
• 2.多巴胺能PC12细胞的氧化应激损伤模型的建立
• 2.1 实验材料及设备
• 2.1.1 细胞系
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 细胞存活率的检测
• 2.2.3 统计学处理
• 2.3 实验结果
• 2O₂对PC12细胞存活率的影响'>2.3.1 H₂O₂对PC12细胞存活率的影响
• 2.3.2 Glu对PC12细胞存活率的影响
• +对PC12细胞存活率的影响'>2.3.3 Mpp⁺对PC12细胞存活率的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3.神经活性成分PCA的分离及鉴定
• 3.1 实验材料及设备
• 3.1.1 药材
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 益智仁提取物制备
• 3.2.3 细胞存活率的检测
• 50值的计算'>3.2.4 IC₅₀值的计算
• 3.2.5 益智仁神经活性组分的提取分离路线
• 3.2.6 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 益智仁神经活性成分PCA的结构鉴定
• 3.3.2 PCA对PC12细胞的毒性作用
• 2O₂损伤PC12细胞的保护作用'>3.3.3 PCA对H₂O₂损伤PC12细胞的保护作用
• 3.3.4 PCA对Glu诱导的PC12细胞损伤的保护作用
• +介导的PC12细胞损伤的保护作用'>3.3.5 PCA对MPP⁺介导的PC12细胞损伤的保护作用
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 2O₂损伤PC12细胞的保护作用'>4.PCA对H₂O₂损伤PC12细胞的保护作用
• 4.1 实验材料及设备
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 乳酸脱氢酶的测定
• 4.2.3 细胞的形态学观察
• 4.2.4 DNA含量的分析
• 4.2.5 谷胱甘肽含量测定
• 4.2.6 超氧化物歧化酶的检测
• 4.2.7 过氧化氢酶的检测
• 4.2.8 谷胱甘肽过氧化物酶的检测
• 4.2.9 蛋白质含量的测定
• 4.2.10 统计学处理
• 4.3 实验结果
• 2O₂损伤致细胞内LDH漏出的影响'>4.3.1 PCA对H₂O₂损伤致细胞内LDH漏出的影响
• 2O₂损伤诱导的PC12细胞凋亡的保护作用'>4.3.2 PCA对H₂O₂损伤诱导的PC12细胞凋亡的保护作用
• 2O₂损伤致细胞内GSH含量变化的影响'>4.3.3 PCA对H₂O₂损伤致细胞内GSH含量变化的影响
• 2O₂损伤致细胞内抗氧化酶活性变化的影响'>4.3.4 PCA对H₂O₂损伤致细胞内抗氧化酶活性变化的影响
• 2O₂／Fe²⁺介导的PC12细胞损伤的保护作用'>4.3.5 PCA对H₂O₂／Fe²⁺介导的PC12细胞损伤的保护作用
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• +介导的PC12细胞凋亡的保护作用'>5.PCA对Mpp⁺介导的PC12细胞凋亡的保护作用
• 5.1 实验材料及设备
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 细胞培养
• 5.2.2 乳酸脱氢酶的测定
• 5.2.3 细胞的形态学观察
• 5.2.4 DNA含量的分析
• 5.2.5 AnnexinV-PI双染检测细胞凋亡和坏死
• 5.2.6 超氧化物歧化酶的检测
• 5.2.7 过氧化氢酶的检测
• 5.2.8 谷胱苷肽过氧化物酶的检测
• 5.2.9 线粒体膜电位的检测
• 5.2.10 活性氧的检测
• 5.2.11 谷胱甘肽含量测定
• 5.2.12 Caspase-3活性分析
• 5.2.13 Bcl-2和Bax蛋白分析
• 5.2.14 蛋白质含量的测定
• 5.2.15 统计学处理
• 5.3 实验结果
• +介导的PC12细胞内LDH漏出的影响'>5.3.1 PCA对Mpp⁺介导的PC12细胞内LDH漏出的影响
• +介导的PC12细胞凋亡的保护作用'>5.3.2 PCA对Mpp⁺介导的PC12细胞凋亡的保护作用
• +介导的PC12细胞内抗氧化酶活性变化的影响'>5.3.3 PCA对Mpp⁺介导的PC12细胞内抗氧化酶活性变化的影响
• +介导的PC12细胞线粒体膜电位变化的影响'>5.3.4 PCA对MPP⁺介导的PC12细胞线粒体膜电位变化的影响
• +介导的PC12细胞ROS产生的影响'>5.3.5 PCA对MPP⁺介导的PC12细胞ROS产生的影响
• +介导的PC12细胞GSH含量变化的影响'>5.3.6 PCA对MPP⁺介导的PC12细胞GSH含量变化的影响
• +介导的PC12细胞caspase-3活性变化的影响'>5.3.7 PCA对Mpp⁺介导的PC12细胞caspase-3活性变化的影响
• +介导的PC12细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响'>5.3.8 PCA对Mpp⁺介导的PC12细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 6.结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 开发前景的展望与本论文存在的不足及有待于进一步完成的工作
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 创新点摘要
• 致谢
• 大连理工大学学位论文版权使用授权书