论文摘要
肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前肝癌的治疗是以手术为主、化疗及其他措施为辅的综合治疗。但肝癌化疗的效果不尽人意,主要原因是肿瘤对多种化疗药物产生了交叉耐药性,即多药耐药（multidrug resistance,MDR）。环境因素对肿瘤的生物学性状有着重要影响,本研究拟探讨肝癌生长的低糖微环境与原发性多药耐药的相互关系,分为以下四个部分:第一部分低糖环境与肝癌多药耐药的产生目的探讨局部微环境低糖与肝细胞癌多药耐药性产生的关系及影响机制。方法低糖培养HepG2细胞,应用流式细胞术Annexin V/PI法检测低糖培养的细胞在化疗药物5-Fu作用后的凋亡情况,分别应用荧光定量PCR技术和Western-blot技术检测低糖培养后HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP的mRNA和蛋白水平的表达。结果在低糖环境下生长时间越长的HepG2细胞对5-Fu的抵抗越强,而且随着低糖培养时间的增加,5-Fu诱导的HepG2细胞的凋亡高峰延迟。低糖培养的HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP在mRNA和蛋白水平的表达随低糖培养时间的延长而升高,以LRP的改变最为显著。结论肝癌生长微环境葡萄糖耐量不足也是肝癌产生MDR的原因之一。低糖可通过上调一组多药耐药相关基因的表达而诱导肝癌的多药耐药性。第二部分缺氧诱导因子1α在低糖环境诱导下肝癌多药耐药形成过程中的作用目的探讨缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在低糖环境诱导的肝癌多药耐药（MDR）表型形成过程中的作用和地位,并为预防和逆转肝癌耐药提供有效的新的分子靶点。方法运用免疫细胞化学技术检测在低糖环境下生长的HepG2细胞内HIF-1α蛋白的表达及定位。应用荧光定量PCR技术和Western-blot技术检测上述条件下HepG2细胞内HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表达。转染pcDNA3/HIF-1α质粒于HepG2细胞,检测转染细胞中多药耐药相关基因mdr1、LRP、MRP1的表达。结果在低糖环境下生长的HepG2细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白均不同程度地高表达,并发生了核转位。pcDNA3/HIF-1α质粒转染HepG2细胞中多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP的mRNA水平较未转染组分别增加了2.4+±.2*、2.2±0.3#、2.3±0.4&倍（*t=3.75,P<0.01;*t=3.42,P<0.01;&t=3.26,P<0.01）,它们在蛋白水平的改变与之一致。结论肝癌生长的微环境可通过核转录因子HIF-1α在转录水平调控多药耐药相关基因的表达,从而诱导肝癌多药耐药表型的形成;HIF-1α的表达上调是微环境诱导肝癌多药耐药形成的中心环节;HIF-1α有望成为预防和逆转肝癌耐药的新的分子靶点。第三部分ERK通路与低糖环境因素诱导肝癌产生多药耐药的胞内信号传导目的探讨ERK/MAPK信号通路在肝癌多药耐药产生中的作用,以阐明微环境因素诱导肝癌产生多药耐药的胞内信号传导途径。方法运用Western-blot技术检测在低糖环境下生长的HepG2细胞内ERK/MAPK的活性。用ERK/MAPK特异性的阻断剂U0126分别处理这些细胞,RT-PCR技术和Western-blot技术分别检测U0126处理组中HIF-1α和多药耐药相关基因mdr1、LRP、MRP1的mRNA和蛋白水平的表达。免疫细胞化学技术检测U0126处理后这些细胞中HIF-1α表达的定位。结果在低糖环境下生长的HepG2细胞中磷酸化/非磷酸化的ERK/MAPK比例均有不同程度地增高。用U0126处理细胞12小时后,这些细胞中多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP的mRNA和蛋白的表达均呈下降趋势,但HIF-1α仅有蛋白表达的减少,其mRNA水平无显著变化。具体数值见文中诸图表。免疫细胞化学染色显示U0126处理后这些细胞中HIF-1α的表达由胞核向胞浆转位。结论ERK/MAPK信号通路是微环境因素诱导肝癌产生多药耐药的重要胞内信号传导途径。微环境因素的刺激通过ERK/MAPK传导至细胞内,使HIF-1α蛋白磷酸化并转位至胞核,增强HIF-1α的转录活性,促进多药耐药相关基因的转录及相应药物泵蛋白的合成,从而导致肝癌产生多药耐药的表型。第四部分利用SiRNA技术分子靶向增强耐药肝癌细胞对化疗药物的敏感性目的探讨HIF-1α特异性siRNA对肝癌化疗的增敏作用。方法合成具有互补序列的能够编码短发夹RNA（shRNA）的双链寡核苷酸,与pSilencer2.1载体构建成相应的真核表达质粒,其转录产物可形成特异性针对HIF-1α靶序列的siRNA。经脂质体稳定转染PSilencer2.1/HIF-1α-siRNA质粒于耐药的C28肝癌细胞系。实验分为三组,PSilencer2.1/HIF-1α-siRNA质粒转染的C28细胞为实验组,PSilencer2.1空载体转染的C28细胞为阴性对照组,C28细胞为空白对照组。用RT-PCR技术和Western-blot技术分别检测三组细胞中多药耐药相关基因mdrl、LRP、MRP1 mRNA和蛋白水平的表达,PI法流式细胞术分析三组细胞在受到5-Fu作用后的凋亡指数。每组细胞分别随机注入10只裸鼠,比较三组细胞成瘤后对ADM治疗的反应性。结果HIF-1α-siRNA能有效地封闭HIF-1a基因、抑制其表达,并能使耐药的C28细胞内多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP的mRNA和蛋白表达明显下降。在5-Fu作用后的第24h,48h和72h,实验组的AI分别是阴性对照组的2.88倍,3.56倍和3.87倍,实验组对化疗药物5-Fu的敏感性显著增强（P<0.01）。裸鼠皮下的耐药肝癌瘤体经阿霉素治疗后,实验组的肿瘤明显缩小,肿瘤抑制率为41.35%,与其它两组相比差异显著（P<0.01）。结论HIF-1α靶序列特异性的siRNA可增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性,它与传统化疗药物的联合应用可望实现对肝癌的有效治疗。
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