人乳铁蛋白基因的克隆及表达载体的构建

论文摘要

人乳铁蛋白（human lactoferrin, hLTF）又称乳转铁蛋白,是人乳汁中主要的铁结合大蛋白,广泛分布于多种组织、体液中,具有提高免疫力,抗菌抑菌,参与铁代谢等多种生物学功能,具有广泛的应用前景。从理论上说动物乳腺组织是表达人乳铁蛋白最为理想的器官。然而,人乳铁蛋白在动物乳腺中高效表达的报道较少。因此,如何构建能高效表达人乳铁蛋白的乳腺特异性表达载体就成为这方面研究的热点。首先,通过高保真PCR法从正常人乳腺组织混合cDNA扩增出2.3kb的人乳铁蛋白cDNA,插入到pMD19-T克隆载体,进行酶切、PCR和测序鉴定。测序结果表明:与GenBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为99. 5%,但所编码的氨基酸序列未发生改变。然后将人乳铁蛋白cDNA亚克隆到经改造的pcDNA3.0载体（pA）中,酶切、PCR和测序鉴定结果证明:人乳铁蛋白真核表达载体pA-hLTF构建正确。然后将构建的pA-hLTF在家兔上进行基因免疫试验,通过采血收集血清,采用酶联免疫法（ELISA）对所收集血清进行检测,结果表明,家兔对注射载体所表达的hLTF产生了免疫应答,且抗体效价达1:1600,从而获得了兔抗人乳铁蛋白多克隆抗体。根据已发表的小鼠乳清酸蛋白（whey acidic protein,WAP）基因序列设计引物,以小鼠基因组为模板,通过高保真PCR技术,扩增乳清酸蛋白5’和3’调控区长度分别为3.5kb和4.6kb的DNA片段,T克隆后测序,测序结果表明,其序列同已发表的小鼠WAP基因序列完全一致。然后基于真核表达载体pcDNA3.0应用体外连接技术连接pcDNA3、WAP5’、WAP3’和hLTF,转化连接产物,以限制性内切酶酶切、PCR验证和琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。鉴定结果证明, hLTF乳腺特异性表达载体pW2-hLTF构建正确。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 正文
• 第一部分 综述
• 一、人乳铁蛋白的研究进展
• 二、动物乳腺生物反应器的研究进展
• 第二部分 试验
• 一、人乳铁蛋白基因的克隆及基因免疫表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 hLTF 基因的PCR 扩增
• 2.2 hLTF基因克隆载体的构建及序列测定
• 2.3 pcDNA3的改造及hLTF真核表达载体构建
• 3 讨论
• 参考文献
• 二、人乳铁蛋白基因免疫兔的实验
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 三、乳清酸蛋白调控区的克隆及人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材 料
• 1.2 方 法
• 2 结果
• 2.1 WAP5’及 WAP3’的 PCR 扩增
• 2.2 WAP5’和 WAP3’基因的 T-克隆鉴定
• 2.3 pcDNA3.0的改造及hLTF乳腺特异性表达载体的构建
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间的论文发表情况