冷胁迫下东农冬麦1号7种转录因子的表达模式与TaOBF1的结合特异性分析

论文摘要

低温、干旱和盐等非生物胁迫对植物的生长和发育有着巨大影响,低温胁迫是影响植物生长和分布的主要影响因素之一。近年来的研究显示基因的表达调控,特别是转录因子在植物响应冷胁迫过程中起到重要作用。冬小麦“东农冬麦1号”是东北农业大学培育的抗冻冬小麦品种,据田间观测数据表明,该品种可以抗-30℃低温冻害。本研究通过对小麦中已知的bZIP等6个家族的7种转录因子在冬小麦东农冬麦1号受极低温度胁迫（-25℃）条件下的表达情况分析,以期寻找冬小麦东农冬麦1号中与冷胁迫有关的转录因子,并对其调控的机制进行研究。TaOBF1转录因子是小麦中的OBF1型转录因子,而TaOBF1和DNA的结合特异性的研究未见报道,因此本研究通过凝胶阻滞试验证明TaOBF1转录因子是否也与G-box具有结合特异性,从而揭示TaOBF1转录因子的调控基因表达的规律,也为冷胁迫下冬小麦基因的表达调控机理研究提供了参考。实验结果显示：1.实时荧光定量PCR表明,在东农冬麦1号中随着温度的降低,转录因子TaOBF1、MYB3和HvWRKY6转录因子基因的表达均呈现先升高后降低的趋势,且变化幅度大于较济麦22。说明上述3种转录因子与冬小麦响应冷胁迫具有相关性。而转录因子DRFL2、FLbaf113d20、 HvWRKY6和NAC69-1基因的表达的规律性较不太显著,说明这4种转录因子与冬小麦响应冷胁迫的关系不明确。2.克隆了全长的TaOBF1转录因子基因,通过构建pET-32b-TaOBF1原核表达载体和优化表达条件获得的融合蛋白,并通过进一步的分离纯化成功获得了高纯度的TaOBF1转录因子蛋白。3.凝胶阻滞实验表明TaOBF转录因子蛋白能与G-box元件结合,而不能与G-box元件的突变体mG-box结合,因此证明TaOBF转录因子蛋白能与G-box元件结合,且这种结合具有特异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 基因表达调控
• 1.1.1 转录因子的功能
• 1.1.2 转录因子的结构
• 1.2 与逆境胁迫相关转录因子的研究
• 1.2.1 NAC类转录因子
• 1.2.2 ERF类转录因子
• 1.2.3 WRKY类转录因子
• 2H₂类转录因子C₂H₂'>1.2.4 C₂H₂类转录因子C₂H₂
• 1.2.5 MYB类转录因子
• 1.2.6 bZIP类转录因子
• 1.3 冬小麦抗寒性有关研究
• 1.4 研究目的及意义
• 2 材料
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设计
• 2.3 试验试剂和仪器
• 2.4 冬小麦7种转录因子在冷胁迫下表达差异的分析
• 2.4.1 RNA的提取
• 2.4.2 RNA纯度的分析
• 2.4.3 DNase Ⅰ消化RNA中的基因组DNA
• 2.4.4 反转录
• 2.4.5 cDNA浓度的调节和ReaL-timePCR引物的效率分析
• 2.4.6 ReaL-time PCR分析
• 2.4.7 数据分析方法
• 2.5 基因的克隆及原核表达
• 2.5.1 PCR扩增目的基因
• 2.5.2 PCR产物的回收
• 2.5.3 克隆载体的构建
• 2.5.4 表达载体的构建
• 2.5.5 目的蛋白的制备
• 2.6 凝胶阻滞（EMSA）试验
• 2.6.1 探针标记
• 2.6.2 检测探针标记效率
• 2.6.3 DNA片段与蛋白结合检测
• 3 结果
• 3.1 两种冬小麦7种转录因子在冷胁迫下表达差异的分析
• 3.1.1 RNA的纯度分析结果
• 3.1.2 实时荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线分析
• 3.1.3 冷胁迫下7种转录因子基因的表达分析
• 3.2 TaOBF1转录因子的原核表达
• 3.2.1 TaOBF1基因的扩增
• 3.2.2 重组质粒pMD18-T-TaOBF1的构建及酶切鉴定
• 3.2.3 重组质粒pMD18-T-TaOBF1插入基因的序列测定及结果分析
• 3.2.4 pET-32b-TaOBF1表达载体的构建
• 3.2.5 重组表达载体插入基因的序列测定及结果分析
• 3.2.6 原核表达目的蛋白
• 3.2.7 目的蛋白的纯化
• 3.3 凝胶阻滞实验（EMSA）
• 4 讨论
• 4.1 冷胁迫对转录因子在两种冬小麦中表达的影响
• 4.2 Real-time PCR反应的稳定性和可靠性
• 4.3 表达体系的选择和优化
• 4.4 蛋白结构分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文