论文摘要
目的建立弓形虫（ Toxoplasma gondii ）、肠出血型大肠杆菌（Enterohehemorrhagic Escherichia coli）O157:H7、痢疾志贺菌（S.dysenteriae）、霍乱弧菌（V.cholera）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、轮状病毒（Rotavirus）G3型及Norwalk病毒（Norovirus）GII型七种病原体的LAMP或RT-LAMP检测方法。方法以各病原体的特异基因为靶序列, PrimerExplorer V3设计46条LAMP引物,利用TIAamp Genomic DNA Kit或酚氯法提取病原体DNA、利用QIAamp viral RNA mini kit提取病原体RNA,配制LAMP或RT-LAMP反应体系,优化反应体系并建立七种病原体检测方法;65℃保温约60 min,完成对靶病原体基因的扩增,扩增结果通过肉眼、SYBR Green I染色及电泳来判定。LAMP扩增产物经酶切进一步鉴定;设立对照组评价特异性;10倍系列稀释模板检测敏感性。结果模板经LAMP后,肉眼、SYBR Green I染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物;七种病原体LAMP扩增产物经相应限制性内切酶酶切鉴定正确;结果显示七种病原体LAMP检测方法特异;LAMP可检测到弓形虫、肠出血型大肠杆菌（EHEC）O157:H7、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、轮状病毒G3型及Norwalk病毒GII型的最低浓度分别是1 pg/μL、10 cfu/ mL、12 cfu/mL、20 cfu/mL、10 cfu/mL、15.6 pg/管、25 pg/管,高于或与PCR敏感性相当。结论建立了七种病原体特异、敏感和快速的LAMP检测方法。
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标签：环介导等温扩增论文; 逆转录环介导等温扩增论文; 检测论文; 病原体论文;