鲢鱼蛋白酶解物的功能性质、抗氧化活性及其ACE抑制肽的制备

论文摘要

丰富的鱼类资源是蛋白质和肽等生命活性物质的重要来源。在我国,鲢鱼属大宗淡水养殖鱼类,由于其肉薄、刺多,泥土与鱼腥味不易去除,因此销售价格较低。鲢鱼作为一种高产低值淡水鱼,具有较高的应用和开发价值。低值鱼类的高值化利用不仅可以解决优良蛋白资源浪费的问题,同时还能开发新型功能性食品素材。为此,本研究以鲢鱼蛋白（SCP）为原料,首先测定其基本成分和氨基酸组成；然后,对鲢鱼蛋白的酶解蛋白酶进行筛选,探讨酶解物的制备方法,以获得不同水解度（DH）的鲢鱼蛋白酶解物（SCPH）,并对各不同DH的酶解物进行功能性质和抗氧化活性的测定；最后,对鲢鱼蛋白酶解条件进行优化,以期在最佳酶解条件下制备ACE抑制活性高的鲢鱼蛋白酶解物,再以此酶解物为原料,通过超滤、凝胶柱分离等方法制备ACE抑制肽,对制备得到的ACE抑制活性最高的组分进行高效液相色谱（HPLC）和氨基酸分析。主要研究结果如下：（1）鲢鱼的蛋白质含量很高,脱脂后可达到91.12%（以干基计）,另外,鲢鱼蛋白还富含亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）和缬氨酸（Val）等人体必需氨基酸,是优质的蛋白质资源,由此可认为,鲢鱼蛋白可作为制备蛋白酶解物的原料。在对鲢鱼蛋白进行酶解时,碱性蛋白酶在所选六种蛋白酶（胰蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶）中效果最好,所以选其作为酶解用酶。鲢鱼蛋白的酶解过程曲线显示：随着酶解时间的延长,DH不断增大,水解速率逐渐减小。因此,在温度和pH等条件固定的情况下,可以通过控制反应时间来控制DH,从而得到不同DH的酶解物。本研究就以此方法制备了DH分别为4.5%、9.0%、13.5%和18.0%的鲢鱼蛋白酶解物。（2）四种不同DH的鲢鱼蛋白酶解物（SCPH）与原鲢鱼蛋白（SCP）相比,其功能性质除持油性以外均有了不同程度的提高。同时,环境pH值也对酶解物的溶解性和乳化性有一定影响。具体结果如下：SCPH的溶解性随DH的提高而增大,在pH2.0-10.0范围内,不同DH的SCPH的氮溶解指数（NSI）值均比原SCP有很大提高,如在pH7.0时,各酶解物的NSI值至少比原SCP的NSI值提高了77.7%；SCPH的持水性随着DH的增大而提高,DH为18.0%的酶解物的持水性比原SCP提高了37.7%,而酶解物的持油性却随着DH的增大而降低,且均低于原SCP的持油性；原SCP的乳化性和乳化稳定性介于低DH酶解物与高DH酶解物之间,DH为4.5%的酶解物的乳化性和乳化稳定性最强,在pH为10.0时,DH为4.5%的酶解物的乳化性比原SCP提高了58.8%；在DH为4.5%时,酶解物的起泡性和泡沫稳定性最好,其起泡性值较SCP提高了20.4%。SCP在酶解后的功能性质的提高为其在食品工业中的应用拓宽了道路。（3）用四种抗氧化体系测定了鲢鱼蛋白（SCP）及鲢鱼蛋白酶解物（SCPH）的抗氧化能力,不同DH的酶解物的抗氧化能力均较SCP有了明显的提高。在所有样品中,DH为13.5%的酶解物具有最强的DPPH抑制能力,在样品浓度为1.6mg/mL时其抑制率为39.95%,这比原SCP的DPPH清除率提高了7.1倍；8mg/mL DH为13.5%的酶解物的还原能力较强,其还原能力比原SCP提高了10.6倍；DH为13.5%的SCPH的超氧阴离子自由基捕获率可在4mg/mL时达到25.45%,是原SCP超氧阴离子自由基捕获率的6.9倍；DH为18.0%的酶解物展现了最强的ABTS+清除能能力,其TEAC值在样品浓度为2.0mg/mL达到1.31μmol/L,比原SCP的TEAC值提高了2.4倍。由以上结果可看出,SCPH的抗氧化性较原SCP有显著提高,因此,可以通过酶解SCP来提高SCP的应用性（4）在以DH为指标,用碱性蛋白酶（Alcalase）水解SCP的单因素试验的基础上,采用响应面分析法对其酶解过程进行了优化,得到的最优酶解条件为：pH8.73、温度54.7℃、[E]/[S]1.78%。在该条件下制备的SCPH的ACE抑制率为76.34%。由响应面分析得到的影响因子对应响应值的函数表达式如下：Y=71.72+4.80A+5.81B+7.75C-6.31A2-9.78B2-9.12C2+4.68BC（5）将在最优酶解条件制备的SCPH进行了超滤和凝胶柱分离,并确定了凝胶分离的较优条件：以Sephadex G-10为填料,以超纯水为洗脱液。在此条件下分离SCPH得到了三个组分：SCPH-1、SCPH-2和SCPH-3。其中,SCPH-3的ACE抑制活性最强,其ACE IC50值为0.40mg/mL。HPLC分析和氨基酸分析结果显示,SCPH-3中非极性氨基酸和芳香族氨基酸的含量相对较高,该组分对于开发具有降血压作用的功能性食品或药物应具有一定的利用价值。

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摘要

ABSTRACT

第1章引言

1.1 研究背景和意义

1.2 生物活性肽的研究进展

1.2.1 ACE抑制肽

1.2.2 抗氧化肽

1.2.3 阿片肽

1.2.4 免疫肽

1.2.5 抗肿瘤肽

1.2.6 其他活性肽类

1.3 生物活性肽的制备分离鉴定技术

1.3.1 生物活性肽的制备技术

1.3.2 生物活性肽的分离纯化技术

1.3.3 生物活性肽的结构分析技术

1.4 降血压肽的研究概况

1.5 肽的ACE抑制机理

1.5.1 血管紧张素转化酶与高血压

1.5.2 ACE抑制肽的ACE抑制活性与降血压的关系

1.5.3 ACE抑制肽的测定方法

1.6 本研究的研究思路及研究内容

第2章鲢鱼基本成分的测定及其蛋白酶解物的制备

2.1 试剂与仪器

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 脱脂

2.2.2 基本成分测定

2.2.3 氨基酸组成的分析

2.2.4 酶活力的测定

2.2.5 不同蛋白酶酶解效果的比较及鲢鱼蛋白酶解物的制备

2.3 结果与讨论

2.3.1 基本成分

2.3.2 氨基酸分析

2.3.3 酶活力的测定

2.3.4 不同蛋白酶对鲢鱼蛋白的水解效果比较

2.4 小结

第3章鲢鱼蛋白酶解物功能性质的研究

3.1 试剂与仪器

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 主要实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 溶解性

3.2.2 持水性、持油性

3.2.3 乳化性

3.2.4 起泡性

3.3 结果与讨论

3.3.1 溶解性

3.3.2 持水性、持油性

3.3.3 乳化性

3.3.4 起泡性

3.4 结论

第4章鲢鱼蛋白酶解物抗氧化活性的研究

4.1 试剂与仪器

4.1.1 材料与试剂

4.1.2 主要实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物对DPPH自由基的捕获能力的测定

4.2.2 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物的还原力的测定

4.2.3 不同水解度酶解物的超氧阴离子自由基捕获能力的测定

4.2.4 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物对DPPH自由基的捕获能力

4.3.2 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物的还原力

4.3.3 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物的超氧阴离子自由基捕获能力

4.3.4 不同水解度鲢鱼蛋白酶解物的ABTS自由基清除率

4.4 结论

第5章鲢鱼蛋白制备ACE抑制肽的酶解优化

5.1 试剂与仪器

5.1.1 材料与试剂

5.1.2 主要实验仪器

5.2 实验方法

5.2.1 碱性蛋白酶（Alcalase）水解鲢鱼蛋白的单因素试验

5.2.2 碱性蛋白酶（Alcalase）水解鲢鱼蛋白最佳酶解条件的优化

5.2.3 ACE抑制率的测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 单因素试验

5.3.2 碱性蛋白酶（Alcalase）水解鲢鱼蛋白最佳酶解条件的优化

5.4 结论

第6章鲢鱼蛋白ACE抑制肽的制备

6.1 试剂与仪器

6.1.1 材料与试剂

6.1.2 主要实验仪器

6.2 实验方法

6.2.1 ACE抑制肽制备流程

6.2.2 超滤

6.2.3 分子量测定

6.2.4 凝胶条件选择

6.2.5 Sephadex G-10凝胶分离

6.2.6 RP-HPLC分析ACE抑制肽

6.2.7 ACE抑制活性比较

6.2.8 氨基酸分析

6.3 结果与讨论

6.3.1 鲢鱼蛋白酶解物的分子量分布

6.3.2 凝胶层析分离效果

6.3.3 鲢鱼蛋白酶解物各组分的ACE抑制活性比较

6.3.4 高效液相色谱分析SCPH-3

6.3.5 SCPH-3的氨基酸分析

6.4 结论

第7章结论

参考文献

附录研究生阶段发表的论

致谢

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