论文摘要
肝癌是一种常见的恶性肿瘤,易转移和复发,患者预后较差。肝癌转移和复发与癌细胞的多种生物学行为（如细胞增殖、凋亡等）密切相关,其中肝癌细胞凋亡的减少及引起信号分子的改变是人类肝脏肿瘤形成和发展的重要原因之一。膜相关鸟苷酸激酶转化蛋白2（membrane-associated guanylate kinase inverted2, MAGI2）也称S-SCAM （synaptic scaffolding molecule）,是一种包含多个结构域、具有募集和锚定细胞信号蛋白作用的支架蛋白。研究发现,MAGI2在脑组织中高表达,同时在人肝癌细胞中表达,它参与脊椎动物中枢神经系统突触的形成及稳定、神经系统疾病的发生与发展,并且是一种潜在的肿瘤抑制因子。星形孢菌素（staurosporine, STS）是一种蛋白激酶C （Protein kinase C, PKC）及其他蛋白激酶类的抑制剂,可促进神经突触的生长,抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的上调,作为常用的细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,但星形孢菌素诱导凋亡的具体机制及影响其诱导凋亡的相关信号分子的表达调控还有待研究,因此其尚未作为化疗药物广泛应用于临床。本课题组曾报道,MAGI2抑制人肝癌细胞的迁移和增殖,但在影响星形孢菌素诱导的肿瘤细胞凋亡方面鲜有报道。探讨MAGI2对星形孢菌素诱导的肝癌细胞凋亡敏感性的影响及其分子机制是本文研究的重点。已有研究证明MAGI2的第三个PDZ （PDZ2）结构域与PTEN蛋白C-末端的PDZ-结合结构域具有高亲和力,MAGI2可能通过与PTEN结合发挥一系列生物学功能。张力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN）是一种具有磷酸酶活性的抑癌基因产物,是抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、调控细胞周期及抑制细胞迁移和增殖等生物学行为的重要调节分子。本课题组也曾发现,MAGI2抑制的人肝癌细胞迁移和增殖的作用与PTEN密切相关,PTEN蛋白质的上调参与了MAGI2对人肝癌细胞迁移和增殖的抑制作用。P13K与AKT组成的PI3K/AKT信号通路在细胞的增殖和存活中起着重要的作用。磷酸化是AKT活性的体现形式,活化的AKT作为细胞存活因子,能降低凋亡因子与增加抗凋亡蛋白的活性。PI3K/AKT信号通路是受多因素调节的,其负反馈主要由PTEN调节。PTEN使PIP3脱磷酸,来维持PIP3的低水平,从而下调PI3K/AKT的磷酸化。本文将主要探索MAGI2通过PTEN信号通路调节STS诱导的人肝癌细胞凋亡及其分子机制。本文分两部分,第一部分研究MAGI2对星形孢菌素诱导的人肝癌细胞凋亡的影响,我们将vector质粒,myc-MAGI2质粒瞬时转入BEL-7404人肝癌细胞株中分别命名为vector-7404和myc-MAIG2-7404细胞。我们发现与vector-7404细胞相比,myc-MAGI2-7404细胞能够促进星形孢菌素诱导的细胞凋亡,并具有时间和剂量依赖性。第二部分对MAGI2增强STS诱导的人肝癌细胞凋亡敏感性的分子机制进行研究,观察发现myc-MAGI2-7404细胞中PTEN蛋白表达增加且降解速度减慢,而PTEN mRNA水平无明显变化。揭示MAGI2是通过抑制PTEN蛋白降解速率而发挥作用,而不影响PTEN mRNA水平。我们用激光共聚焦方法证明了MAGI2与PTEN可发生共定位形成复合物,加入星形孢菌素使得共定位作用增强,提示myc-MAGI2-7404细胞中MAGI2与PTEN结合可能通过增强MAGI2-PTEN复合物的形成从而阻止PTEN的降解。我们针对PTEN进行RNA干扰使PTEN蛋白表达下调,并检测MAGI2促进的细胞凋亡敏感性,结果显示,PTEN表达的下调有效抑制了MAGI2促进的STS诱导的细胞凋亡。我们进一步研究了在MAGI2促进的STS诱导细胞凋亡过程中AKT的作用,结果表明,MAGI2通过与抑癌基因产物PTEN相互作用能够降低AKT的磷酸化水平,从而加速了STS诱导的肝癌细胞凋亡。综上所述,过表达MAGI2可引起PTEN蛋白表达明显上调,其机制是MAGI2通过加强与PTEN的相互作用,抑制了PTEN蛋白质降解速率；PTEN通过其脂质磷酸酶活性作用降低AKT的磷酸化水平,从而参与MAGI2促进的STS诱导的人肝癌细胞凋亡敏感性。支架蛋白MAGI2通过与PTEN相互作用从而促进细胞凋亡,实现其抑癌功能。本文结果提示上调MAGI2蛋白水平可以改变肝癌细胞的部分恶性生物学行为,为分子干预治疗肝癌提供针对性的靶点,希望有助于更深入的了解肿瘤发生发展的本质,为将来肿瘤治疗提供新的策略。
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