论文摘要
目的胶质瘤性脑水肿是胶质瘤发生发展过程中一个重要的病理生理变化。它不仅与许多胶质瘤患者临床症状的产生密切相关,同时,它所导致的颅内压升高是造成胶质瘤患者预后不良及死亡的重要原因。地塞米松的应用使胶质瘤患者死亡率显著下降,这与它能快速降低脑水肿及修复受损的血脑屏障密切相关,然而,地塞米松降低脑水肿、修复血脑屏障的分子机制仍然不十分清楚。水通道蛋白（AQPs）是最近发现的一组与水通透性有关的细胞膜转运蛋白,它是生物膜水转运的分子基础,而在血脑屏障的星形胶质细胞血管终足上大量表达的AQP4蛋白,是决定血脑屏障水转运的重要因素。研究中发现在细胞毒性脑水肿模型中敲除AQP4基因大鼠,其水肿程度和颅内压明显减轻,而在血管源性脑水肿模型中敲除AQP4基因大鼠,水肿程度和颅内压则明显增高。从基因敲除的模型研究中可以看出脑组织中AQP4蛋白具有双向水转运功能,弄清AQP4蛋白在脑水肿中的作用及表达调控机制,对于研制脑水肿的有效治疗方法是十分必要的。研究证实AQP4蛋白在脑肿瘤组织水肿的调节代谢中起重要作用。地塞米松是临床上降低肿瘤性脑水肿的常规用药,我们最近研究发现地塞米松能下调脑出血大鼠脑组织AQP4蛋白的表达,降低出血性脑水肿的产生,但地塞米松是否通过调节肿瘤大鼠脑组织AQP4蛋白表达降低胶质瘤性脑水肿尚未见报道。AQP4蛋白存在于血脑屏障上,参与血脑屏障的形成,鸡胚发育9天时脑组织中未发现,14天时少量表达,20天时达到成熟水平,表明脑组织AQP4蛋白表达与血脑屏障的成熟过程一致。脂多糖模拟血脑屏障损伤后,脑组织AQP4蛋白表达上调,研究证实脑损伤性疾病伴有血脑屏障损伤时AQP4蛋白表达显著上调,而没有血脑屏障损伤的脑组织AQP4蛋白表达无显著改变,提示瘤周脑组织AQP4蛋白表达的改变可能与脑水肿和血脑屏障的通透性改变有关。最近,一些研究报道脑组织中表达的AQP4蛋白作为渗透压感受器,在脑的渗透压感受区域表达,对于水的集聚起重要作用。在第三脑室周围的下丘脑区AQP4蛋白表达上调能促进水的排出和脑脊液的产生。上述研究表明AQP4蛋白参与渗透压平衡和血脑屏障完整性的调节。以往的研究证实地塞米松能促进血脑屏障完整性的恢复,减少炎症细胞因子产生,进而减少渗透压的改变。而AQP4蛋白促进脑损伤处水的吸收和损伤远端水的排出。因此,我们推测地塞米松通过调节不同脑区AQP4蛋白的表达,促进水肿液从脑肿瘤周围区向远端第三脑室脑区清除,进而维持肿瘤近端脑区和远端脑区间渗透压的平衡。胶质瘤性脑水肿病人血脑屏障通透性增加,而地塞米松能降低血肿瘤屏障的通透性,但是地塞米松降低血肿瘤屏障通透性的分子机制尚不完全清楚。血脑屏障是由血管内皮细胞、基膜和星形胶质细胞血管终足构成的。正常的脑血管内皮细胞缺乏转运囊泡、内皮间存在连续的紧密连接。脑胶质瘤病人的脑血管内皮细胞被肿瘤破坏,肿瘤血管内皮细胞的超微结构显示:转运囊泡增加,细胞水肿和紧密连接破坏,即细胞旁通路和跨细胞通路开放。研究发现地塞米松应用7天后脑水肿的减轻与血肿瘤屏障通透性降低相关,在培养的正常脑血管内皮细胞里,地塞米松导致脑血管内皮细胞上紧密连接相关蛋白occluding和ZO-1的上调和去磷酸化。我们推测地塞米松可能通过调节血肿瘤屏障上的紧密连接相关蛋白occluding表达降低血肿瘤屏障的通透性。跨细胞转运是药物通过血肿瘤屏障的又一重要途径,主要通过增加囊泡转运导致血肿瘤屏障通透性增强,关于地塞米松对跨细胞转运途径的影响,目前尚未见报道。血肿瘤屏障上的ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATPchannel)和钙离子激活性钾通道(Calcium-activated potassium channel,KCachannel)是血肿瘤屏障上跨细胞途径的两个重要靶点,它能有效地诱导脑肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞上转运囊泡的加速形成。研究发现血管内皮细胞上的钾通道是糖皮质激素调节的重要靶点。地塞米松可以调节血管平滑肌细胞上的KATP通道,可通过丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶和蛋白激酶A调节脑垂体CH3和AtT-20细胞上的KCa通道活动,我们推测地塞米松可能通过调节脑肿瘤组织的KATP通道和KCa通道参与跨细胞转运的调节。地塞米松降低脑水肿是否与调节不同脑区AQP4蛋白表达有关?地塞米松对血肿瘤屏障的通透性影响的分子机制是什么?这些问题目前尚不清楚亟待解决。方法1、复制大鼠C6胶质瘤模型。收集培养的C6胶质瘤细胞1×106/10μl,通过立体定位仪种于动物大脑右侧尾状核,约14天形成荷瘤鼠。2、应用干湿重法检测地塞米松给药前后C6胶质瘤大鼠脑组织含水量的变化。3、应用免疫荧光法检测地塞米松给药前后C6胶质瘤大鼠不同脑区AQP4蛋白的分布和表达水平的变化。4、应用RT-PCR法,Western blot法分别检测地塞米松给药前后C6胶质瘤大鼠不同脑区AQP4mRNA和蛋白表达的变化。5、应用伊文思兰法（Evans blue,EB）检测地塞米松、缓激肽及地塞米松与缓激肽联合应用后C6胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性的变化。6、应用Western blot法检测地塞米松、缓激肽及地塞米松与缓激肽联合应用后C6胶质瘤大鼠脑肿瘤组织紧密连接相关蛋白occluding、KATP通道的Kir6.2亚基,KCa通道的α-亚单位表达的变化。7、应用免疫组织化学法检测地塞米松、缓激肽及地塞米松与缓激肽联合应用后C6胶质瘤大鼠脑肿瘤组织KATP通道的Kir6.2亚基,KCa通道的α-亚单位表达的变化。8、应用全细胞膜片钳技术检测地塞米松、缓激肽及地塞米松与缓激肽联合应用后大鼠C6细胞的IKATP,IKCa电流的变化。结果1、成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型。2、地塞米松作用后,C6胶质瘤大鼠脑组织含水量显著降低。3、AQP4蛋白在正常脑组织中表达于星形胶质细胞血管终足上,在C6胶质瘤大鼠瘤周水肿区脑组织中表达显著增多呈弥漫性分布。4、地塞米松作用1天后,C6胶质瘤大鼠瘤周水肿区脑组织AQP4mRNA表达显著下调,地塞米松作用3天后,该区脑组织AQP4蛋白表达显著下调。5、地塞米松作用1天后,C6胶质瘤大鼠第三脑室周围的下丘脑区脑组织AQP4mRNA表达水平显著增加,地塞米松作用3天后,该区脑组织AQP4蛋白水平显著增加。6、地塞米松作用3天后,C6胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性显著降低。7、地塞米松作用3天后,C6胶质瘤大鼠脑肿瘤组织紧密连接相关蛋白occluding表达显著增加。8、地塞米松作用3天后,C6胶质瘤大鼠脑肿瘤组织中KATP通道的Kir6.2亚基表达显著增加,但大鼠C6细胞的IKATP电流密度无显著增加。9、地塞米松作用3天后,C6胶质瘤大鼠肿瘤组织中KCa通道的α-亚单位表达显著增加,但大鼠C6细胞的IKCa电流密度无显著增加。10、地塞米松作用3天后,缓激肽诱导的大鼠肿瘤细胞IKCa电流密度、IKATP电流密度显著增加。结论1、C6脑胶质瘤大鼠瘤周水肿区脑组织中AQP4蛋白表达上调,但第三脑室下丘脑区的AQP4蛋白表达未见改变。2、地塞米松下调C6脑胶质瘤大鼠瘤周水肿区脑组织中AQP4蛋白表达,上调第三脑室区脑组织中AQP4蛋白表达。3、地塞米松上调C6脑胶质瘤大鼠肿瘤组织中紧密连接蛋白occluding表达。4、地塞米松上调C6脑胶质瘤大鼠肿瘤组织中KATP,KCa通道的蛋白表达。5、地塞米松增强缓激肽诱导的大鼠肿瘤细胞IKCa电流密度和IKATP电流密度。6、地塞米松降低血肿瘤屏障通透性,但未抑制缓激肽诱导的血肿瘤屏障通透性增加。
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