糖多孢红霉菌酮还原酶基因的克隆及其在手性醇中的应用

论文摘要

具有特定功能基团的手性醇是合成手性药物的重要中间体,从羰基化合物不对称还原合成手性醇,已成为手性合成的一个重要部分。在羰基的不对称催化还原反应研究中,生物催化以其温和的反应条件、对环境的压力较小和较高的光学选择性,在羰基不对称还原合成中占有很重要的地位。选择合适的生物催化剂对于生物催化至关重要。2006年Bali等报道了短链脱氢酶家族（short-chain dehydrogenase superfamily, SDR）成员之一的糖多孢红霉菌聚酮合成酶中的酮还原酶对很多的底物,都有比较好的生物选择性还原能力,特别是对结构中含有环己酮的底物。本实验以糖多孢红霉菌基因组作为DNA供体,并根据2005年Alexandros的报道设计特异性引物,扩增野生型的糖多孢红霉菌聚酮合成酶中的酮还原酶域基因（eryKR1）。再根据Genbank中报道的eryKR1基因和放线菌素聚酮合成酶中的酮还原酶基因（ActKR）,设计了用于定点突变的特异性引物,利用重叠PCR技术将KR1中决定其底物特异性的位点定点突变为ActKR中决定其底物专一性的那段基因位点,得到突变的KR1片段命为eryKR1M。将其克隆到表达载体pET-28a上,从中挑选阳性克隆菌株pET-eryKR1和pET-eryKR1M进行测序。用同样的方法构建重组质粒pET-GDH作为辅酶再生。将重组质粒pET-GDH,pET-eryKR1和pET-eryKR1M转化到大肠杆菌BL21中进行表达。加定量的IPTG诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。最后通过发酵检验野生型和突变后的酮还原酶对四种底物（4-氯乙酰乙酸乙酯,苯乙酮,2-辛酮和环己酮）还原作用。结果表明,扩增eryKR1,eryKR1M基因的最佳退火温度为68℃,GDH基因的最佳退火温度为54℃。扩增的eryKR1,eryKR1M和GDH基因所对应的蛋白序列与报道的同源性高达98%。pET-eryKR1M中的目标基因与Genbank中报道的KR1基因仅在控制底物专一性的位点处不同,被放线菌素聚酮合成酶中的酮还原酶基因（ActKR）上的这段位点所取代,这也与我们设想一致。另外,SDS-PAGE检测出eryKR1,eryKR1M,GDH目标蛋白带。最后,发酵实验结果表明野生型的eryKR1对环己酮有很好的还原作用,而eryKR1M对环己酮的作用降低。这为今后该工程菌应用于手性醇的生物催化奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 手性药物
• 1.2 手性化合物的获得
• 1.2.1 手性源
• 1.2.2 消旋体拆分
• 1.2.3 不对称合成
• 1.3 生物催化羰基不对称还原生成手性醇
• 1.3.1 生物催化羰基不对称合成手性醇的反应机理
• 1.3.2 生物催化羰基不对称合成手性醇的微生物或酶
• 1.3.3 氢供体与辅酶再生
• 1.3.4 辅酶再生系统
• 1.3.5 全细胞催化与酶催化的比较
• 1.3.6 改善生物催化羰基不对称还原反应立体选择性的方法
• 1.4 本实验要做的工作
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 培养基及其培养条件
• 2.1.4 主要溶液的配置
• 2.1.5 工具酶
• 2.1.6 试剂及试剂盒
• 2.1.7 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 糖多孢红霉菌的DNA 大量提取
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌的基因组DNA 的提取
• 2.2.3 DNA 的PCR 扩增
• 2.2.4 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 DNA 的回收纯化
• 2.2.6 质粒的提取
• 2.2.7 PCR 回收纯化片段和pET-28a 质粒的双酶切
• 2.2.8 片段的连接
• 2.2.9 大肠杆菌DH5α/BL21 感受态细胞的制备和转化
• 2.2.10 挑选菌落，提取重组质粒pET-KR1，pET-KR1M 和pET-GDH
• 2.2.11 重组质粒的双酶切鉴定
• 2.2.12 将重组质粒转化到BL21 感受态细胞中（同2.2.8）
• 2.2.13 SDS-PAGE 电泳上样样品的制备
• 2.2.14 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 2.2.15 凝胶的染色和脱色
• 2.2.16 发酵种子的培养
• 2.2.17 酶的诱导
• 2.2.18 底物的还原
• 2.2.19 发酵产物的提取和气谱初步检测
• 第三章 重组质粒 pET-GDH 的构建
• 3.1 葡萄糖脱氢酶（GDH）的PCR 扩增及电泳检测
• 3.1.1 枯草芽孢杆菌基因组DNA 的提取及检测
• 3.1.2 引物设计
• 3.1.3 PCR 产物和纯化产物的电泳图
• 3.1.4 酶切回收产物GDH 与载体pET-28a 的连接及双酶切鉴定
• 3.2 GDH 的结果比对
• 3.3 SDS-PAGE 检测产物蛋白量
• 第四章 重组质粒 pET-eryKR1 的构建
• 4.1 PCR 扩增目的基因及电泳检测
• 4.1.1 糖多孢红霉菌基因组DNA 的提取
• 4.1.2 引物设计
• 4.1.3 PCR 扩增产物及电泳图
• 4.1.4 pET-ERY 重组质粒的提取和双酶切鉴定
• 4.2 测序结果比对
• 4.3 SDS-PAGE 检测蛋白表达量
• 第五章 重组质粒 pET-KR1M 的构建
• 5.1 PCR 扩增目的基因及电泳检测
• 5.1.1 糖多孢红霉菌基因组DNA 的提取
• 5.1.2 引物设计
• 5.1.3 PCR 扩增产物及电泳检测
• 5.1.4 PCR 片段和质粒pET-28a 的双酶切和所需片段回收与连接
• 5.1.5 转化后质粒的提取和双酶切鉴定
• 5.2 测序结果比对
• 5.3 SDS-PAGE 检测蛋白质的表达量
• 5.4 有关构建基因工程菌的几点讨论
• 5.4.1 PCR 扩增目的基因
• 5.4.2 PCR 产物的回收
• 5.4.3 小片段DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 5.4.4 质粒的提取
• 5.4.5 感受态细胞的制备
• 5.4.6 连接转化
• 5.4.7 SDS-PAGE 凝胶的脱色
• 第六章 重组菌的发酵
• 6.1 底物为环己酮的发酵结果
• 6.2 底物为COBE 的发酵结果
• 6.3 底物为苯乙酮的发酵结果
• 6.4 底物为2-辛酮的发酵结果
• 第七章 结论
• 7.1 本实验取得的实验结果
• 7.2 对实验的展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者在读期间发表的相关论文
• 附图