论文摘要
第一部分hDectin-1E的亚细胞定位及与RanBPM相互作用的研究C型凝集素样受体Dectin-1是一个Ⅱ型跨膜的细胞表面受体,与自然杀伤细胞表面的C型凝集素样受体具有高度的同源性。Dectin-1作为β-1,3/β-1,6-葡聚糖的受体,能够介导β-葡聚糖的识别和内化。Dectin-1主要表达在树突细胞,巨噬细胞和中性粒细胞等细胞表面,在一些非专业的抗原递呈细胞表面也有表达,如HEK293T细胞。Dectin-1含有胞浆尾部,跨膜区以及胞外段三部分,其中胞外段含有单个的C型凝集素样结构域（CTLD）和一个颈部区,胞浆尾部含有免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）。Dectin-1由于其未成熟的pre-mRNA的选择性剪接,产生多个异构体。人的Dectin-1有两种主要的（A和B）和六种次要的（C-H）异构体。异构体A和B是β-葡聚糖的主要受体,而后六种异构体的功能尚不明确。在这六种异构体中,异构体E（hDectin-1E）结构非常特殊,其N末端含有ITAM基序,C末端为完整的C型凝集素样结构域。与异构体A（hDectin-1A）相比,它缺少了部分胞浆区,跨膜区和颈部区,但是目前对其生物学功能尚未研究。由于跨膜区的缺失,可能导致hDectin-1E与全长的Dectin-1有着不一样的亚细胞定位。我们首先通过免疫荧光和免疫印迹等实验方法,证实了hDectin-1E不能被分泌到细胞外,也不能定位到细胞表面,而主要定位于细胞胞浆中。为了进一步研究hDectin-1E的功能,以hDectin-1E的完整的C型凝集素样结构域作为诱饵,利用Gal 4酵母双杂交系统筛选人的胸腺cDNA文库。经过三轮营养缺陷筛选,我们鉴定了一个构架蛋白RanBPM作为hDectin-1E的一个相互作用蛋白。通过体外结合实验我们证实了它们的相互作用,并且表明RanBPM的SPRY结构域在与hDectin-1E相互作用中是必须的。在体内实验中我们通过免疫共沉淀进一步证实了hDectin-1E与RanBPM的相互作用,免疫荧光共聚焦分析也揭示了它们在细胞中存在共定位。RanBPM作为一个构架蛋白,具有介导蛋白质与蛋白质的相互作用,整合信号传导通路等功能。RanBPM招募胞浆中的hDectin-1E,可能有助于hDectin-1E N末端的ITAM基序的活化以及其介导的细胞信号传导,但具体的生物学功能还有待进一步研究。第二部分Hsp60作为Dectin-1潜在的配体及其激活巨噬细胞成熟机制的研究Dectin-1作为β-葡聚糖的受体,能够介导β-葡聚糖的内化和其诱导的生物学效应。β-葡聚糖是许多真菌细胞壁的主要成分,因此,Dectin-1能够识别真菌细胞壁中的酵母聚糖并在机体抵御真菌感染的过程中发挥着重要作用。当Dectin-1结合其配体后,导致其胞浆尾部的ITAM样基序被Src磷酸化,从而招募Syk酪氨酸激酶,激活下游信号传导,诱导活性氧的产生和呼吸爆发,杀灭病原微生物,介导TNF-α等细胞因子的分泌从而进一步调节机体的免疫。除了能够识别β-葡聚糖之外,Dectin-1还能识别T细胞表面的内源性配体,促进T细胞的增殖,并且这种识别不能被酵母聚糖所抑制。此外,研究表明Dectin-1也能够结合HEK293细胞表面的尚未鉴定的配体,当细胞凋亡时这种结合能力增加,表明Dectin-1所识别的配体在细胞凋亡时表面表达水平增加。但是,Dectin-1所识别的内源性配体还有待进一步鉴定。我们在利用酵母双杂交分析,在人胸腺cDNA文库中筛选与Dectia-1的C型凝集素样结构域相互作用的蛋白。我们筛选到一个血浆中可溶性蛋白Hsp60。在哺乳动物中,Hsp60作为一个伴侣分子定位在细胞线粒体中,参与了线粒体内蛋白质折叠。在外界环境的压力下,包括感染,应激等,Hsp60可以易位到胞浆,细胞膜,还可以分泌到细胞外,能够调节免疫系统的功能。Hsp60被抗原递呈细胞内化,促进抗原递呈细胞的成熟和细胞因子的分泌。然而,介导Hsp60内化的受体目前还尚未鉴定。因此,我们推测Dectin-1可能作为Hsp60的受体。在我们的实验中,我们证实了Dectin-1作为Hsp60的受体,能够结合并内化Hsp60。通过表面能量共振分析表明它们的结合解离常数为1.04e-6M。我们也表明了Hsp60能够快速激活Syk酪氨酸激酶,通过使用Syk抑制剂抑制Syk活性表明Syk位于MAPK信号通路的上游。此外,Hsp60以Syk酪氨酸激酶依赖的方式促进巨噬细胞成熟和诱导促炎症因子的分泌。因此,Dectin-1作为Hsp60的受体,将为以Hsp60作为治疗药物的研究提供基础和新的思路。第三部分鼠CLEC-2异构体的鉴定及分子属性研究CLEC-2是通过使用含有免疫学功能的C型凝集素结构域筛选基因组数据库组时被鉴定的。人的CLEC-2（hCLEC-2）是一个Ⅱ型跨膜的C型凝集素样受体,其中胞外段含有单个的C型凝集素样结构域和一个颈部区,胞浆尾部含有D-x-Y-x-x-L基序。最近研究表明,hCLEC-2能够识别外源性配体蛇毒Rhodocytin和内源性配体Podoplanin,导致Y-x-x-L基序磷酸化,招募Syk酪氨酸激酶从而激活血小板。另外,它还能够协同DC-SIGN促进血小板捕获HIV-1。鼠的CLEC-2（mCLEC-2）与hCLEC-2具有高度的同源性,缺失Ca2+依赖性糖基结合位点和含有D-x-Y-x-x-L基序,目前对其研究较少。在我们克隆mCLEC-2的过程中,除了已经报到的全长形式外,我们克隆了2个尚未报道的选择性剪切异构体（mCLEC-2B,mCLEC-2C）。通过Northern Blot分析我们进一步表明了我们鉴定的异构体在组织中的存在。这两个新的异构体已提交到Genebank（EF070191和EF070192）。与全长相比,mCLEC-2B缺少跨膜区,有一个594bp的开放性读框;mCLEC-2C缺少跨膜区和部分CTLD从而导致了mCLEC-2C的mRNA编码序列预先终止而只有252bp的开放性读框。通过RT-PCR反应我们检测了mCLEC-2三个异构体在不同组织以及细胞系中的表达情况,两个新的异构体与全长的mCLEC-2有着不一样的组织分布和细胞表达。进一步也研究表明,mCLEC-2B和mCLEC-2C都不能被分泌到细胞外,也不能定位到细胞膜表面,而主要定位于细胞浆中。进一步的研究也表明,细胞膜表面的mCLEC-2能被细胞表面的蛋白酶剪切并释放到培液中,形成可溶形式的CLEC-2（sCLEC-2）,并且这种剪切能被aprotinin和PMSF蛋白酶抑制剂所抑制,表明这种剪切可能是由aprotinin和PMSF敏感的蛋白酶所剪切的。此外,在mCLEC-2的颈部存在一个半胱氨酸残基（Cys80）,通过免疫印迹和点突变等实验表明,细胞表面的mCLEC-2能够通过分子间的二硫键形成二聚体,培液中可溶形式的sCLEC-2也部分以同源二聚体的形式存在。因此,这些研究将为进一步阐明mCLEC-2的功能奠定基础。
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标签：凝集素样结构域论文; 酵母双杂交论文; 受体论文; 配体论文; 小鼠论文; 选择性剪接论文; 蛋白水解论文; 同源二聚体论文;